运用液体通气培养方法制备猪链球菌灭活疫苗试验

xiaoz 网络

2012-08-13 23:05:06

【导读】运用液体通气培养方法制备猪链球菌灭活疫苗试验杨涛甘伏生摘要：猪链球菌病是人畜共患的、由多种致病性链球菌感染引起的急性、热性传染病，其主要特征是急性出血性败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎以及...

运用液体通气培养方法制备猪链球菌灭活疫苗试验杨涛甘伏生摘要：猪链球菌病是人畜共患的、由多种致病性链球菌感染引起的急性、热性传染病，其主要特征是急性出血性败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎以及关节炎，发病猪群的死亡率可以达到80%以上、被列为二类动物疫病。猪链球菌还可以感染特定人群发病，严重的可导致死亡，防治该病可用猪链球菌病灭活疫苗。为了GMP车间的发展，加快工厂化生产步伐，提高产量，我们模拟了灭活苗车间制备灭活苗过程中的工艺条件和环境要求，运用液体通气培养的方法制备猪链球菌灭活疫苗，已获得初步成功，现将过程和结果报道如下关键词：猪链球菌液体通气培养灭活疫苗一、材料和方法 1、材料牛肉购于回民食品批发市场；猪胃购于万吨冷库生鲜批发市场各种化学试剂、器械等均由湖北省精牧兽医技术开发有限公司质量监察室提供猪链球菌株由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提供 2、方法: 制备马丁肉汤培养基 ⑴猪胃消化液猪胃300克盐酸10毫升蒸馏水1000毫升步骤分为消化、煮沸、调PH值、过滤分装、灭菌备用 ⑵牛肉汤牛肉500克水1000毫升步骤分为加热保温、煮沸、过滤分装、灭菌备用制备马丁肉汤时，只需取⑴、⑵的相同数量混合，另按每1000毫升加入氯化钠2.5克，加热至70℃左右调PH7.8－8.0，煮沸10分钟，过滤分装，116℃30－40分钟。马丁琼脂培养基取马丁肉汤培养基加入一定比例的琼脂，调PH值，121℃30分钟，稍冷却后就可于无菌环境倾倒平皿，也可在倾倒之前按一定的的比例加入血清和裂解血二、制备过程一级种子的制备：在无菌条件下，开启冻干菌种13株，分别接种到含5－10％无菌血清马丁肉汤培养基试管中，至37℃温箱培养，作为一级种子，与此同时，对冻干菌种进行纯粹检验，将开启的菌种分别涂片，革兰氏染色镜检；然后，分别接种马丁血琼脂平板。37℃需氧培养24h后，分别挑取典型菌落涂片染色镜检，可见革兰氏阳性（紫色）短链球形或卵圆形细菌，也有单个散开或成双排列，无芽孢，有的可见到荚膜。二级种子的制备：取经纯粹检验后的一级种子，在无菌条件下分别接种到含5-10％无菌血清马丁肉汤培养基三角烧瓶中，培养基的用量是一级种子的10倍，同时接种一定数量马丁琼脂血清平皿，一起放37℃需氧培养24h作为二级种子，再次进行纯粹检验，结果与一级种子一致，即可作为二级种子（生产用）三、通气培养根据发酵罐的构造原理，我们用血清瓶做为罐内层，加热水箱当作罐体夹套的构思，设计了试验的路线，具体方法是：将血清瓶橡胶盖上打孔二个，插入不锈钢管，两头均露出一段，一根不锈钢管的瓶外端接通纯净的压缩空气；瓶的内端连接白乳胶管直至瓶底部，胶管的远端部分钻有一定数量小孔，顶端的圆形开口封闭；另一根不锈钢管的瓶外端连接一个排气球。事先要将血清瓶和盖子等附属物件分开包好，121℃30分钟备用，配制马丁肉汤培养基装入其中，121℃30分钟，备用，将血清瓶等用品放车间物流入口，无菌处理，人员严格按照下列程序进入：进入门厅，将携带物品（雨具等）存放于指定位置。在更鞋区脱下自己的鞋，换上工作鞋，进入一更衣室，脱外衣裤，放好，摘掉各种饰物用流动纯化水对手部进行清洁，进入二更室更换二更洁净拖鞋，更换洁净服，戴洁净帽、口罩，将衣袖口扎紧，扣好领口，头发全部包在帽子里边不得外露。从二更室进入缓冲间，将手伸至感应灭菌器处75%乙醇溶液喷洒消毒；（在手消毒后经洁净走道，到物流入口处，拿取物品放在操作间的物流缓冲间），通过洁净走道进入三更室，脱掉洁净工作服及内衣裤，进入盥洗室，淋浴，换上无菌内衣裤，穿上万级洁净区连体无菌工作服及洁净拖鞋，戴口罩。手部再次消毒，进入操作间。在无菌操作间，加入5-10血清于血清瓶中，加入纯粹检验合格的二级种子，扎好瓶口，拿出在发酵间运用无菌的方法，将血清瓶放置到加温水箱里，水箱的工作控制温度设定在37.5℃，无菌连接纯净压缩空气接口，微调压缩空气调节阀，看到血清瓶内有少量的小气泡产生即可，每1小时观察记录水箱的温度，进气和产生气泡的情况 18-24小时，无菌取样，涂片镜检，计数、小白鼠毒性试验、涂片镜检：与一级种子纯粹检查结果一致，合格；细菌计数：采用10倍稀释的方法，9㎝的马丁肉汤琼脂培养基接种稀释好的菌液0.1毫升放置于37℃培养箱培养24小时，计数平皿上的菌落，达到制苗的要求；小白鼠毒性试验：腹腔内注射18-24小时的培养物0.2毫升数日内死亡，小白鼠尾巴发绀，剖检肝、脾、肺、心出血，呈败血症。灭活：用分析纯甲醛试剂，按1%的用量加入到培养的菌液中，摇动，继续放在水箱中，每隔2小时摇动一次，24小时后用平皿法和动物实验检查灭活效果，无菌生长、动物正常即可进入下一道程序。配苗：用生理盐水稀释商品氢氧化铝胶，消毒灭菌后按菌液5、铝胶1的比例混匀，分装、贴签，配好的成品，安检合格、甲醛含量合格。
四、结论：运用液体通气培养的方法制备猪链球菌疫苗，设计思路、操作程序、制备工艺是成功的，车间生产可借鉴其过程，对指导生产有一定的实用价值。 ————————————————————————————— 甘伏生、男、1960、湖北省农业科学院、技师、兽医生物制品研发

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