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警惕猪场“幕后黑手”——圆环病毒病（超全病理图）(2)

yilucaihong 网络

2019-10-15 02:25:26

【导读】 1．3 引物上游引物U：5 ’-AGT GAG CGG GAA AAT GCAGA-3’，下游引物L：5’-TCC TCC GTG GAT TGT TCTGT-3 ’，由上海生工生物技术有限公司合成。 1．4血清抗体的ELISA检测按照猪圆环病毒病间...

1．3 引物

上游引物U：5 ’-AGT GAG CGG GAA AAT GCAGA-3’，下游引物L：5’-TCC TCC GTG GAT TGT TCTGT-3 ’，由上海生工生物技术有限公司合成。

1．4血清抗体的ELISA检测

按照猪圆环病毒病间接ELISA检测试剂盒说明进行抗体检测。

1．5血清样品中PCV2核酸的PCR检测

1．5．1 DNA的提取

从ELISA检测阳性的血清样品中随机取14份用于PCV2 DNA提取。DNA提取过程如下：取300

μL血清，加入等体积的组织裂解缓冲液，再加入蛋白酶K(20 mg／mL)至终浓度50μg／mL，于50℃消化2 h；取出消化产物，加入等体积的Tris饱和酚，充分振荡混匀后，4℃12 000 r／min，离心10 min；取上层水相500 μL转入l支1．5 mL Eppendorf管中，加入等体积的酚．氯仿．异戊醇混合液，混匀后，4℃12 000 r／min，离心10 min；取上层水相400 μL转入另1支1．5 mL Eppendorf管中，加入800μL预冷无水乙醇和3 mol／L NaAc(pH 5．2)40斗L，在一20℃放置l—2 h或室温放置30 min以沉淀病毒DNA；4 ℃ l2 000 r／min，离心10 min，弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀，自然干燥后溶于20汕灭菌蒸馏水中，立即用于PCR反应或一20℃保存备用。

1．5．2 PCR扩增

PCR反应体系为50μL，包括10×PCR缓冲液5μL，10 mmol／L dNTPs 4μL，5 U／μL Taq DNA聚合酶lμL，25 pmol／L上、下游引物各1 μL；DNA模板3μL，无菌去离子水38μ L。PCR扩增条件为94℃预变性3 min；94℃变性45 S，56 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，32个循环；72 ℃延伸l0min。DNA产物用1．2％琼脂糖凝胶电泳检测。

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