猪干扰素基因在腺病毒的表达及应用

多年来，疫苗免疫接种一直是一种预防大范围传染病爆发的最为有效的措施之一。目前被广泛用来进行免疫控制传染病以及自身免疫病和癌症等疾病的治疗。免疫接种的优点是促使先天性免疫细胞产生免疫记忆细胞，从而使机体针对特定的病原体产生持久的免疫保护。疫苗接种不仅可以通过注射灭活苗或弱毒苗实现，还可以通过注射亚单位疫�?如纯化的类毒�?实现，也可以由其它方式将抗原呈递给免疫系统、�/p>

尽管疫苗接种非常成功，但免疫失败也时常出�?例如猪瘟疫苗)，而且屡见不鲜，具体原因尚未明确。有些疫苗能够提供短期保护，不能使机体产生免疫记必�有些疫苗能够使机体产生免疫记忆，但却不能使机体针对抗原产生有效的免疫保护。强烈的免疫反应并不不一定保证形成保护性免疫。例如，呼吸道的感染可以导致保护性免疫失效，而且现在形成了很多综合症，如猪圆环病毒、猪呼吸与繁殖综合症病毒等都是以综合征来危害动物机体。从疫苗开发的角度来看，在没有保护性免疫的干扰下，产生稳固的免疫应答的感染是一个非常有前景的研究领域。在免疫学领域，一些新的、功能强大的研究工具已经开始广泛使用，这主要归功于在宿主与病原体相互作用方面得到了新的见解，并进一步理解了以细胞和分子为基础的保护性免疫。保护性免疫应答不仅仅是抗原特异性的结果，更是体内环境各种因素、各种因子相互作用、相互影响的综合结果。因此，疫苗开发的重点应当从目前只考虑抗原特异性向抗原特异性和体内环境综合考虑转变，这必定是今后发展的新方向，也是目前大家对自然免疫、天然免疫研究非常火热的最重要的原因之一。新知识和新技术的获得必将使研究人员按照新的方式改造疫苗和体内环境综合考虑来对抗传染病，从而研制更为有效、更容易形成具有选择性保护和持久性的免疫记忆的新的免疫疫苗及相关产品。其中，干扰素作为研究的非常彻底的一种细胞因子，起到了很好的疗效，本文主要介绍猪I型干扰素、�/p>

1957 � Isaac � Lindenman 进行鸡胚细胞流感病毒感染试验中首次发现一类能干扰和抑制病毒复制的可溶性细胞分泌物，故取名为干扰素( interferon Wheelock � Green 分别� 1965 年和 1969 年相继发现免疫活性细胞经丝裂原或抗原刺激后，发生一类对酸敏感的干扰素，称为免疫干扰素。目前依据干扰素对酸的敏感性通常分为 I 型干扰素(酸敏感型)� II 型干扰素(耐酸�?两类。几乎所有脊椎动物均可产生这两类干扰素，根据发生干扰素细胞种类不同， I 型干扰素至今已发� INF- α � β � ω � κ � τ � δ� 6 种类型，� II 型干扰素迄今为止仅发� INF- γ一�? Domeika, 2003 由于干扰素具广谱、高效抗病毒功能，及其对免疫系统起关键调节作用，因此成为当今免疫学、遗传学和分子生物学研究最为活跃的领域之一、�/p>

1、细胞因子及干扰素概忴�/p>

细胞因子是由机体各种细胞合成分泌的具有多种生理活性和参与病理反应的小分子可溶性蛋白质、�/p>

干扰素是在特定的诱导剂作用下，由特定细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白，当它再作用于其他细胞时，使其它细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力。具有广谱抗病毒活性和调节细胞功能。其分类如下９�/p>

2、猪干扰素及其基因结枃�/p>

目前所发现的猪干扰素包� INF- α � β � ω � δ� INF- γ ，并� INF- δ未在其它物种中发�? Domeika, 2003 � INF- α � ω分别是由 12 个和 5 个以上的相关功能基因编码的蛋白质家族，这些两种干扰素的各亚型之间同源性很高，天然 INF- α常常� INF- α � ω功能基因表达产物的混合体，� INF- β � δ� INF- γ仅由单一基因编码( Bonnardiere, et al., 1994 现在已完成基因克隆、测序和定位的猪干扰素基因主要包� INF- α � β � ω� INF- γ 等、�/p>

3、干扰素作用及机琅�/p>

干扰素作用见下图、�/p>

I型干扰素主要抑制病毒复制，主要是通过诱导细胞合成多种�?2�?5’寡聚腺苷酸合成酶等)和旁分泌作用实现的。可以抑制细胞的增殖(如肿瘤细胞等);加强NK细胞杀伤病毒感染细胞的能力(NK细胞具有干扰素受�?;改变 MHC分子的表达，增强MHCⅠ类分子的表达而抑制MHCⅡ类分子的表达、�/p>

IFNγ抗病毒活性较Ⅰ型低，但它的免疫调节和抗细胞增殖的作用较强，所以又称免疫干扰素，它是一种强的巨噬细胞、NK细胞、血管内皮细胞活化剂，能激活巨噬细胞并促进其活�?能直接作用于T和B淋巴细胞，促进分化；能增强MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子的表达、�/p>

IFN具有广谱的抗病毒作用：病毒增殖量减少、传播速度减慢以及感染细胞损伤程度降低。其作用机理是：①通过抑制某些病毒的吸附、脱壳和最初的病毒核酸转录，病毒蛋白合成以及成熟病毒的释放等不同环芁�②通过NK、巨噬细胞和CTL杀伤病毒感染细胞� IFN的抗病毒活性具有相对的种属特异性。IFNγ > IFNα/β ;不同病毒对IFN抗病毒作用的敏感性也不同。RNA病毒 > DNA病毒� IFNγ：病毒长期感染控制、�/p>

IFNα/β的免疫调节功能： 主要通过对淋巴细胞和巨噬细胞的调节以及诱导MHC I型分子的表达实现、�/p>

IFNγ的免疫调节功能：更为强大。显著增加病毒感染细胞和抗原递呈细胞表达MHC II型分子、增强T细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒性T细胞产生的能力。促进NK细胞的杀伤活性、�/p>

4� 猪干扰素的基因工程研究及抗病毒研穵�/p>

Lefevre et al.(1990)利用大肠杆菌表达猪�?干扰素，5-10��10^7 U/mg; Vandenbroeck et al.(1993)利用大肠杆菌表达猪γ干扰素�?0^7 U/mg; Cencic et al.(1999)利用RK-13细胞系表达猪γ干扰素，2��10^6 U/mg; 郭瀛军�?2001)利用大肠杆菌表达猪γ干扰素�?0^7 U/mg;陈涛�?2002)利用大肠杆菌表达GST-IFN α�?200 U/mg;万建青等(2002)利用酵母表达猪γ干扰素�?50-540 U/mL，在Marc-145细胞上抵抗PRRSV感染;曹瑞兵等利用酵母表达猪� 干扰素，2.5��10^5 U/mL，表达量60μg/mL，比活�?.17 ��10^6 U/mg，在PK-15细胞上显著抑制猪流行性腹�?PEDV)的增殖、�/p>

口蹄疫病毒：Chinsangaram et al.(2002)研究发现大肠杆菌表达的猪α或β干扰素对口蹄疫病毒有抑制作用。Moraes和Mason et al.(2004)将一定剂量的表达PoIFNα的腺病毒第一次接种猪体后16h就可使猪获得对FMDV强毒攻击的保护，�?d内完全保护，�?d内有保护效果、�/p>

抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)作用：Buddaert et al.(1998)研究了PRRSV与PoIFNα的相互作用�?1) PoIFNα处理细胞后显著降低PRRSV的增殕�(2)在猪体内证明了PRRSV对PoIFNα的敏感性，给猪注射PRCV(可诱导内源性PoIFNα)�?d再接种PRRSV，其增殖滴度下降1.7-2.9lg TCID50。Albina et al.(1998)以PRRSV鼻腔接种猪后5d内，猪血清中PoIFNα含量一直较低，大部分猪的肺部分泌物检测不到PoIFNα� PoIFNα的下调可能与PRRSV增殖有关。Bautista et al.(1999)研究发现猪γ干扰素可显著抑制PRRSV在肺泡巨噬细胞上的生长，与剂量和作用时机有关、�/p>

抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)作用: Cummins et al.(1995)在TGEV暴发时，�?-12日龄的仔猪分�?组，分别连续4d口服1U�?0U�?0U的HuIFNα，口服干扰素的仔猪存活率明显高于对照组、�/p>

抗伪狂犬病毒(PRV)作用: Pol et al.(1991)发现� PoIFNα能够抑制PRV强毒和中等毒力病毒在猪鼻腔粘膜组织基质细胞层的增殖，PRV接种经干扰素处理的猪成纤维细胞和猪肾细胞，其病毒滴度明显下降。Tonomure et al.(1996) HuIFNα处理Vero细胞后PRV的增殖受到抑制、�/p>

5、国内猪干扰素研究进屔�/p>

国内主要进行了如下研究：猪α干扰素在杆状病毒中表达及其对PRRSV 的抑制作用；α干扰素在猪流感病毒感染急性期的作�?用干扰素防制猪传染性胃肠炎效果奼�猪α干扰素对猪圆环病毒2 型亚单位疫苗免疫效果的影哌�猪I 型与II 型干扰素的克隆、表达及抗病毒活性比辂�猪干扰素α 在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检浊�猪α干扰素基因的克隆、原核表达及生物学活性鉴定；猪α干扰素/ 白细胞介�? 基因的融合表达及活性研�?PRRSV);白细胞干扰素治疗猪蓝耳病的临床效果；猪�?干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测宙�猪基因工程复合干扰素对仔猪病毒性疾病防治效果观察；重组猪�? 干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物学活性研穵�重组猪干扰素2γ的体外抗弓形虫作�?猪� 干扰素的原核表达及抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测宙�重组猪α干扰素治疗高致病性猪蓝耳病的研穵�猪�?干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作�?猪白细胞干扰素对高致病性“蓝耳病”的防治；猪白细胞干扰素防治猪传染性胃肠炎的体伙�表达猪γ干扰素的重组腺病毒的构建和活性鉴宙�猪白细胞干扰素对高致病性猪“蓝耳病”的防治;猪白细胞干扰素在临床上的治疗效果报告;猪白细胞干扰素治疗高热病效果显著等等、�/p>

6、我们利用腺病毒表达系统表达干扰素的优势、及单纯干扰素的猪场试验

真核表达系统，能进行翻译后的修饰，如糖基化、S-S;载体相对稳定，易于获得高滴度� 1012可以达到;高感染性和广谱性：多种动物、多种细胞；多种给药途径：注射、饮氳�安全性：缺陷型，一过性感染表达。每批次的产品进行严格的质量检测，完全保证产品质量，可以进行生物学活性检测，和无菌检验、�/p>

我们表达的干扰素可以在实验室内很好的抑制病毒在细胞上的生长。同时我们进行了干扰素在现地猪场的试验，使用方法是：肌肉注射。体重≤50kg�?.5ml/头；体重�?0kg�?.0ml/头。每头每日注射一欠�病重者每天可注射两次，连� 3-5 日。现汇报如下

试验一：莒�?浮来山镇.长安口村.赵廷升猪场，共养300多头猪全部发生口蹄疫�?0号开始用干扰�?圈共67头，体重15公斤�?0公斤重，截至�?号为止，只死�?头其它稳定，没用干扰素的正在继续治疗，病情没有好转� 结论：用干扰素的病猪效果明显见好，没用干扰素治疗的死亡率高，治愈率慢，用干扰素有很好的疗效、�/p>

实验二：莒县.洛河�?罗米庄四�?周绪军猪�?�?号开始部分猪�?8�?病状体温�?9.5℃到41.5℃呼吸稍快，耳，尾及四肢发紫认为可能是蓝耳病，我们采取用干扰素治�?6�?号死亡一头，第四�?5头稍有好转、�/p>

实验三：莒县.龙山�?周家庄村，周备峯猪场，有20多头猪有病症状：气喘身上发紫，体�?8.5℃到39℃不吃食，只少量的喝点水，发病已�?天，用干扰素2次之后死�?头。其他基本上稳定不死亡、�/p>

结论：发�?天之内用该干扰素效果会好点、�/p>

以上实验只是单纯应用我们的干扰素进行，如果配合其他药物，效果会更好、�/p>

7、干扰素产品临床应用效果及效果分枏�/p>

河南王彦彬博士也研制了干扰素，以下病例是由其提供(南阳农校袁录教授试验)９�/p>

案例一、蒲山养殖场�?年以上饲养年限，150头育肥猪的养殖规模，试验数量20�?发病20�?，治疗时间：2010�?�?3日。体重：70kg、�/p>

发病日龄：已发病5天、�/p>

临床症状：发病猪体温41-42℃，粪便干燥，不食，喜卧，下腹部有出血点或者淤血点，眼角有黄色分泌物，耳朵发蓝，边缘坏死，腹下与肛门周围呈蓝色、�/p>

用药史：分别用过青霉素、安乃近及其他复方制剂，不见明显效果。目前无死亡、�/p>

临床诊断：初步判定为猪瘟和蓝耳病的混合感染、�/p>

用药方案：干扰素1�?头，肌注，每天一次，连用三天。人用头孢曲� 2�?头，肌注，每天一次，连用三天。增食针 2�?头，肌注一次、�/p>

恢复结果：第二天见到效果，第四天部分猪恢复正常，5天后全部恢复正常。无复发情况、�/p>

案例二、槐树湾养猪场，4年以上饲养年限，100头育肥猪的养殖规模，试验数量16�?发病22头，已死�?�?，治疗时间：2010�?�?5日。体重：75kg、�/p>

发病日龄：已发病10天、�/p>

临床症状：发病猪体温41-42℃，粪便干燥，不食，喜卧，下腹部有出血点或者淤血点，眼角有黄色分泌物，鼻盘有明显的水泡，蹄踵开裂，蹄冠部有水疱，部分已破溃。跛行或不能站立、�/p>

用药史：分别用过磺胺类复方制剂、安乃近及其他复方制剂，不见明显效果。已经死�?头、�/p>

临床诊断：初步判定为猪瘟和口蹄疫的混合感染、�/p>

用药方案：干扰素1�?头，肌注，每天一次，连用三天。头孢噻�?1g�? 1�?头，肌注，每天一次，连用5天、�/p>

恢复结果：第三天见到效果，第四天�?头猪恢复正常，另�?头停药后3天恢复正常。无复发情况、�/p>

案例三、麒麟湖养猪场，5年以上饲养年限，80头育肥猪的养殖规模，试验数量18�?发病24头，已死�?�?，治疗时间：2010�?�?6日。体重：85kg、�/p>

发病日龄：已发病7天、�/p>

临床症状：发病猪体温41-41.5℃，稽留热，粪干，不食，耳朵、腹下与肛门周围呈蓝色，呼吸急促，有点喘，个别有咳嗽症状，有时腹泻、�/p>

用药史：分别用过磺胺类复方制剂、及其他复方制剂，详细问不出来，不见明显效果。已经死�?头、�/p>

临床诊断：初步判定为高热病和呼吸系统感染的混合感染、�/p>

用药方案：干扰素1�?头，肌注，每天一次，连用三天。泰乐菌� 2�?头，肌注，每天一次，连用5天。氟苯尼考注射液�?�?头，肌注，每天一次，连用5天、�/p>

恢复结果：第三天见到效果，第四天�?头猪恢复正常，第五天�?头恢复，另外4头严重的开始好起来，停药后2天恢复正常。无复发情况、�/p>

分析：以�?个案例只是临床试验的一个缩影，有明显的代表性。从中可以看出干扰素的临床使用效果是显著的，并且3天的注射试用就明显的控制了疾病的发展，其后续效果可以一直持�?-7天。从而使病情跟进一步的恢复，不会复发。其长效性、作用快的特性表现出明显优势、�/p>

8� 前景与展朚�/p>

IFN功效：猪干扰素是一类具有抗病毒和免疫调节活性的细胞因子，是猪体抵御病原入侵的重要早期防御系统之一。重组猪干扰素可以作为一类高效的抗病毒和免疫调节生物制剂、�/p>

IFN生产工艺：与传统诱导血液淋巴细胞产生干扰素相比，基因工程干扰素具有产量大和纯度高、更易规模化生产、产品质量更易控制的优点。利用基因工程技术生产重组干扰素是一条有效的途径、�/p>

市场：中国是一个养猪大国，有多种病毒性传染病一直困扰着养猪业的发展、�/p>