前言
猪繁殖与呼吸系统综合征（PRRS）是猪的一种传染病，导致母猪繁殖障碍以及生长猪呼吸系统疾病，是世界范围内具有重要经济学意义，可以引起重大经济损失的疾病。最近一种非典型的、高致病性蓝耳病病毒变异株（HP-PRRS）在中国以及东南亚国家发生。该病以超过41℃高烧、厌食、全身及耳部发红（“蓝耳”）为特点，可导致各年龄阶段的猪高死亡率。目前疫苗对不同的蓝耳病病毒毒株或高致病性蓝耳病病毒只能提供有限的保护力。最近，有研究报道显示大环内酯类抗生素可能对蓝耳病毒具有抗病毒作用。疫苗和药物的联合使用可能对蓝耳病的预防更为有效。在本研究中，大环内酯类抗生素泰万菌素被用来测定对高致病性蓝耳病病毒在体外复制的抗病毒活性，以及对细胞内线粒体超氧化物生成的影响。
材料与方法
37℃条件下，使用不同浓度（0.1, 1, 10,和100µg/ml）的泰万菌素处理MARC145 细胞4 小时。处理过后，使用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞5 次。采用间接免疫荧光，细胞分别接种TCID50 效价是102 和103 的高致病性蓝耳病病毒（HP-PRRSV）越南分离株100186-614，培养24 和48 小时。细胞用80% 丙酮固定，采用感染高致病性蓝耳病毒（HP-PRRSV）越南分离株100186-614 的病猪血清样品和异硫氰酸荧光素标记的抗猪IgG进行间接免疫荧光试验。最后在荧光显微镜下观察。
在流式细胞试验检测中，使用泰万菌素处理过后，细胞接种TCID50 效价为5×105 的高致病性蓝耳病毒分离株100186-614，孵育48小时。细胞采用4%的多聚甲醛固定后，采用0.5% 皂素将细胞通透。采用一种类似间接免疫荧光的方法对细胞进行染色。高致病性蓝耳病毒抗原阳性细胞的总数通过测定10000个细胞中阳性细胞数EPICS XLADC全自动数字化流式细胞仪进行分析并使用EXPO32 软件进行计算。
为了测定细胞中线粒体超氧化物生成量，在用100 µg/ml的泰万菌素处理细胞后，细胞与5 µmol/L MitoSOX（分子探针，英俊公司，美国尤金市）一起在37℃温育30分钟，然后使用含有钙、镁的Hank缓冲盐溶液对细胞洗涤两次，最后使用4%的多聚甲醛固定细胞。为了检测细胞中线粒体超氧化物生成量，流式细胞仪488 nm激光激发MitoSOX探针，并收集575 nm通道（FL）数据。结果数据采用MitoSOX荧光平均密度直方图的形式表示。
结果
在间接免疫荧光实验中，对细胞使用100 µg/ml浓度的泰万菌素进行预处理的细胞中高致病性蓝耳病病毒抗原明显减少。但是与对照相比，病毒阳性细胞的减少没有在其他浓度处理的细胞中表现出来。在流式细胞检测中，当细胞采用100 µg/ml泰万菌素预处理后，高致病性蓝耳病病毒的复制下降了约20%（表1）。但使用其他浓度泰万菌素预处理的细胞与对照组相比，蓝耳病病毒阳性率与对照组无差异。在细胞中线粒体超氧化物的生成量检测试验中，当细胞用100 µg/ml的的泰万菌素处理4小时后，流式细胞检测显示MitoSOX探针荧光强度增加了2.1±0.3倍（图1）。
结论和讨论
在本试验中，采用泰万菌素处理可以减少表达高致病性蓝耳病病毒抗原的细胞数量。这些数据表明泰万菌素具有抗病毒活性，可以减少高致病性蓝耳病病毒在体外的复制。这种抗病毒活性很有可能与细胞中线粒体的超氧化物生成量的增加具有相关性。
今后对于泰万菌素的抗病毒机制还需要更进一步的研究，并且期望能够在体内具有抗病毒作用。（文章摘自第23届世界猪病大会会议论文，2014年6月8-11日，第582页。参考文献略。）
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泰万菌素体外抑制高致病性蓝耳病病毒复制[摘译]
表1. 流式细胞检测高致病性蓝耳病病毒阳性细胞的比率
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泰万菌素体外抑制高致病性蓝耳病病毒复制[摘译]
图1. 泰万菌素增加MARC145细胞中某些线粒体超氧化物。对照组：不做处理。试验重复了三次。
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泰万菌素体外抑制高致病性蓝耳病病毒复制[摘译]
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