4.1.1器材：微量移液器、倒置显微镜等
4.1.2试剂
4.1.2.1 IPMA诊断板的制备：见附录B。 4.1.2.2 标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用清稀释至工作浓度
4.1.2.3 洗涤液、血清稀释液和显?底物溶液依照附录A自行配制
4.1.3样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内?℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液?0倍稀释
4.2操作方法
略
4.2.1 取已?0倍稀释的被检血清加入IPMA诊断板同一排相邻的2个病毒感染细胞孔(V+)其后?个未感染细胞?V-)内每?0μL，同时设立标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，以血清稀释液代替血清设立空白对照，封板并于4℃条件下过夜
4.2.2 弃去板中液体，用洗涤液洗?次，每孔100μL，每?min~3min，最后在吸水纸上轻轻拍干
4.2.3 每孔加入工作浓度的兔抗猪过氧化物酶结合物50μL，封板后放在保温盒内?7℃恒温箱中感?0min
4.2.4 弃去板中液体，洗涤三次，方法?.2.2
4.2.5 每孔加入显色/底物溶液50μL，封板于室恒(180℃~24?下感?0min
4.2.6 弃去板中液体，洗?次，方法?.2.2，再用三馏水洗涤2次，最后在吸水低上轻轻拍干，待检
4.3 结果判定与解
将IPMA诊断板置于倒置显微镜判读。在对照标本都成立的前提下，即空白对照感染细胞孔(P·V+)和未感染细胞?P·V-)均应为阴性反库标准阳性血清对照感染细胞孔(P·V+)应呈典型阳性反应，未感染细胞孔(P·V-)应为阴性反库标准阴性血清对照感染细胞孔(N·V+)和感染细胞孔(N·V-)均应呈阴性反库被检血清未感染细胞?V-)不应出现阳性反应。被检血清标本的细胞?可能仅见于部分细?出现弥漫状或团块状棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性，记作IPMA(+);无棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA(-)。IPMA(+)者表明被检猪的血清中含有PRRS病毒的抗体。 5 间接免疫荧光试验(IFA)
5.1材料准备
5.1.1器材：荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等
5.1.2试剂
5.1.2.1 IFA诊断板的制备：见附录B
5.1.2.2 兔抗猪异硫氰酸荧光黄(FITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供
5.1.3 样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS液作20倍稀释
5.2 操作方法
5.2.1 取IFA诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，置超净工作台中风干，每孔加100μL PBS液洗一次，弃去PBS液并在吸水纸上轻轻拍干
5.2.2 在编号对应的孔内加入20倍稀释的被检血清：同一排相邻的感染细胞?个及其后感染细胞?个，每孔100μL，同时做标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用PBS液代替血清。置37℃恒温箱中感?5min
5.2.3 弃去板中血清，用PBS液洗?次，每孔100μL，每?min，最后在吸水纸上轻轻拍干
5.2.4 每孔加入工作浓度的兔抗猪FITC结合?0μL，在37℃恒温箱中感?5min
5.3 荧光显微镜检查及判定与解
荧光显微镜采用蓝紫光(激发滤板通常用BG12，吸收滤板用OG1或GG9)，在5倍~10倍目镜下检查。标准阳性血清对照中感染细胞?P·V+)应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞?P·V-)不应出现特异性荧光，标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞?N·V+)和未感染细胞?N·V-)均不应出现特异性荧先被检血清对照中未感染细胞孔(C·V-)不应出现特异性荧光。被检血清样品感染细胞孔(N·V+)出现特异性胞浆亮绿色荧光判为阳?否则，判为阴性。 6 间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)
6.1 材料准备
6.1.1 器材?6孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿等
6.1.2 试剂
6.1.2.1 PRRS病毒抗原和正常细胞对照抗原，由国家指定单位提供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度
6.1.2.2 兔抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物(简称酶标抗?由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度
6.1.2.3 PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供。使用前说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度
6.1.2.4 抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等，依照附录A自行配制
6.1.3 样品：采集被检猪血液分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液?0倍稀释
6.2操作方法 参考图2 6.2.1 包被抗原：取96孔平底微量反应，于奇数列加工作浓度的病毒抗原，偶数列加工浓度的对照抗原，每孔100μL(参照?)，封板，置保湿盒内放37℃恒温箱中感?0min，再移置4℃冰箱内过夜
6.2.2 洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔100μL，洗?次，每次1min.在吸水纸上轻轻拍干
6.2.3 封闭：每孔加入封闭液100μL，封板后置保温盒?7℃恒温箱感作60min.
6.2.4 洗涤：方法同6.2.2
6.2.5 加血清：反应板按?编号后，对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。每份血清各?个病毒抗原孔?个对照抗原孔，孔位相邻。每孔加样量均为100μL。封板，置保湿盒内于37℃恒温箱中感?5min
6.2.6 洗板：方法同6.2.2
6.2.7 加酶标抗体：每孔加工作浓度的酶标抗体100μL，封板，放保温盒内置37℃恒温箱中感?5min
6.2.8 洗板：方法同6.2.2
6.2.9 加底物：每孔加入新配制的底物溶液100μL，封板，?7℃恒温箱中感?5min
6.2.10 加终止液：每孔添加终止液100μL终止反应
6.3 光密?OD)值测定与计算
6.3.1 OD值测定：在酶标测定仪上用λ=650nm读取反应板各孔溶液的OD值，记入专用表格
6.3.2 OD值计
按下式分别计算标准阳性血清、标准阴性血清和被检血清与2个平行抗原孔反应的OD值的平均值
标准阳性血?P)与病毒抗?V)反应的均值P·V(OD650)按式(1)计算
P·V(OD650)=(OD650)+B1(OD650)]/2…………………?1)
标准阳性血?P)与对照抗?C)反应的均值P·C(OD650)按式(2)计算
P·V(OD650)=(OD650)+B2(OD650)]/2…………………?2)
标准阴性血?N)与病毒抗?V)V(OD650)按式(3)计算
N·V(OD650)=(OD650)+D1(OD650)]/2…………………?3)
被检血?S)与病毒抗?V)反应的均值S. V(OD650)按式(4)计算:
S·V(OD650)=(OD650)+E1(OD650)]/2 (以S1血清为?……………?4)
被检血?S)与对照抗?C)反应的均值S. C(OD650)按式(5)计算:
S·V(OD650)=(OD650)+E1(OD650)]/2 (以S1血清为?……………?5)
6.3.3 按式(6)计算被检血清OD值与标准阳性血清OD值的比值S/P
S/P=/…?6)
6.4 结果的判定与解释
6.4.1 有效性判宙P·V (OD650)与N·V(OD650)的差值必须大于或等于0.150?才可进行结果判定.否则,本次试验无效.
6.4.2 判定标准与解
A) S/P比值小?.3,判定为PRRS病毒抗体阴?记作间接ELISA(一).B) S/P比值大于或等于0.3,小于0.4,判定为疑?记作间接ELISA(±).C) S/P比值大于或等于0.4,判定为PRRS病毒抗体阳?记作间接ELISA(+).
间接ELISA(+)者表明被检猪血清中含有PRRS病毒抗体.7 血清中和试?SN)
7.1 材料准备
7.1.1 器材:96孔细胞培养板、微量移液器、二氧化?CO2)-恒温箱、倒置显微镜等
7.1.2 病毒:美洲标准株ATTCVR-2332或欧洲标准株LV,由国家指定单位提?使用前按附录C方法滴定病毒效价?用含20%健康猪新鲜血清的EMEM营养?pH7.2)将其稀释至200TCID50/25μL,作为工作病毒?
7.1.3 细胞:MARC-145或HS2H传代细胞,由国家指定单位提?使用?用细胞分散液消化、分散细?计数,再用EMEM营养?含犊牛血?0%,青霉?00IU/ml,链毒?00μg/mL,pH=7.2)稀释至106细胞/ml.
7.1.4 试剂
7.1.4.1 PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血?由国家指定单位提?使用前经56℃灭?0min,并按说明书规定进行稀?
7.1.5 样品:无菌采集被检猪血?血清必须新鲜、透明、无溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃保存或立即送检，检测的?6℃灭?0min。由于中和抗体产生稍晚，故该血清以在疾病中后期或病毒感染后2~3周时采集为宜
7.2 操作方法
图略
7.2.1 加营养液:?6孔细胞培养液,编号,于各血清检测孔内加入EMEM营养??0%犊牛血清?00IU/ml青霉素?00μg /ml链霉素，pH=7.2)25μl,细胞对照区各孔加50μl,病毒对照区各孔不?
7.2.2 加被检血渄单头微量移液器精确吸取已作灭活处理的被检血?在各排头两孔各加?5μl。每份被检血清须平行安排两排，即每个稀释度两孔
7.2.3 稀释被检血渄从第2列开始依次向后将被检血清作倍比稀? 使第2????列孔的血清稀释倍数依次?1?2?3?4?5。稀释时，用8头微量取样器先在?列孔内吹吸数?充分混匀后吸?5μl移入??同前混匀后取25μl移入??以下依次进行.当第6列各孔混匀?各吸?5μl弃去.稀释过程中切勿产生气泡.
7.2.4 稀释对照血渄?.2.3法进行标准阳性血清和标准阴性血清稀?
7.2.5 加病毒液:除血清性对照、病毒对照和细胞对照外，各孔添加用含20%健康猪新鲜血清EMEM营养液，将病毒液稀释成200TCID50/25μL工作病毒?5μl
7.2.6病毒对照：取灭菌试管4支，?0%健康猪新鲜血清EMEM营养?pH7.2)将病毒液稀释至含毒量为200TCID50/25μL?0TCID50/25μL?TCID50/25μL?.2TCID50/25μL4个滴?然后参照?各取25μL加入相应的孔?每个滴度4个孔)，再于各孔内?5μl2倍稀释的标准阴性血?此时,病毒浓度分别降为100TCID50/25μL?0TCID50/25μL?TCID50/25μL?.1TCID50/25μL.
7.2.7 中和感作:将培养板放入37℃的5%二氧化碳保湿恒湿箱中感作60min.
7.2.8 添加细胞:于每孔内加入配制好的MARC-145或HS2H细胞悬液50μL.
7.2.9 培养：封板后，放?7℃的5%二氧化碳保湿恒温箱内培养
7.3 观察与记
在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作?CPE)。每天观察一次，连续观察5天，并将观察结果记入专用登记表内。PRRS病毒在MARC-145或HS2H细胞上生长，引起的CPE主要是：细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落
7.4 中和效价计算和结果判
在各对照组合下述要求时，本次中和试验才成立
a)病毒对照：病毒浓度为0.1TCID50的各孔不应出现任何CPE?00TCID50的各孔均应出现CPE。 b)血清毒性对照：相当于试验中最低稀释度(本标准中??的被检血清对细胞应没有任何毒性作用。 c)细胞对照：在整个试验中应一直保持良好的形态和特征。 d)阳性血清对照：试验中所显示的能抑制CPE出现的血清最高稀释度不应比其已知滴度?个滴度以上。 e)阴性血清对照：各稀释度幸免应出CPE
对被检血清的中和效价进行计算。其血清中和效价为能抑制平行两孔或两孔中一孔出现CPE的血清最高稀释倍数的倒数。血清中和效价大于或等于1?，判定为血清中和试验阳性，记作SN(+);小于1?，判为阳记，记作SN(?。SM(+)表示被检猪血清中含有PRRS病毒抗体
8 综合判定
当在临床上怀疑有PRRS病毒感染时，可根据实际情况，由上述五种方法中选用一种或两种方法进行确诊。对于未接种过PRRS疫苗或已超疫苗免疫期的猪，经任何一种方法检测呈现阳性结果时，都可最终判定为PRRS病毒感染猪。对接种过PRRS灭活疫苗并在疫苗免疫期内的猪，当病毒分离鉴定试验为阳性结果时，可终判为PRRS病毒感染?当仅血清学试验呈阳性结果时，应结合病史和疫苗接种史进行综合判定，不可一律视为PRRS病毒感染猪。 附录A
血清学试验中试剂的配制
A1 PBS?0.01mol/L PBS,pH=7.2)用于IFA
氯化?NaCl) 8g;氯化?KCl) 0.2g;碳酸氢钠(NaHCO3)1.15g;磷酸二氢?KH2PO4)0.2g;三蒸水加 1000ml;保存?℃备用
A2 洗涤?0.01mol/L PBS-0.05%吐温-20，PH=7.4)用于IPMA和间接ELISA
磷酸二氢?KH2PO4) 0.2g;磷酸氢二?Na2HPO4·12H2O) 2.9g;氯化?NaCl)8.0g;氯化?KCl) 0.2g;吐温-20 0.5ml;三蒸水加 1000ml;现用现配
A3抗原稀释液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)用于间接ELISA
碳酸?Na2CO3) 1.59g;碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g;三蒸水加 1000ml;44℃保存，一周内用完
A4 血清稀释液用于IPMA和ELISA
为含1%犊牛血清的“A1”液
A5 封闭液用于间接ELISA
为含1%犊牛血清白蛋白?0%马血清的“A1”液
A6 显色/底物溶液用于IPMA
A6.1 AEC贮存
称取氨乙基咔?3-amino-9-ethy1-earbazole，AEC)4mg溶于二甲基甲酰胺(N，N-dimethy-for-mamid)4mL中，充分溶解后置4℃避光保存
A6.2 乙酸钠溶
乙酸?CH3COONa) 4.15g加三馏水 1000mL用冰乙酸调整至pH=5.0
A6.3 乙酸盐缓冲液
冰乙?CH3COOH) 12.8mL;乙酸钠溶 35.2mL
A6.4 显示/底物溶液(AEC-H2O2)
乙酸盐缓冲液 19mL;AEC贮存 1mL;30%过氧化氢(H2O2) 0.067mL;充分混合后装于褐色玻璃瓶内避光存放。现用现配
A7 底物溶液用于间接ELISA
A7.1 0.1mol/L磷酸氢二钠溶
柠檬?C6H8O7) 1.92g 加三馏水 100mL
A7.2 0.1ml/L磷酸氢二钠溶
磷酸氢二?Na2HPO4·12H2O) 3.58g 加三馏水 100mL
A7.3 底物溶液(TMB-H2O2)
0.1 mol/L柠酸溶液 33.0mL;0.1 mol/L磷酸氢二钠溶 66.0mL;四甲基联苯胺(TMB)40.0mg;30%过氧化氢(H2O2) 1.5mL;充分混合后装于褐色玻璃瓶避光存放。现用现配
A8 终止液用于间接ELISA
1 mol/L 氢氟?HF)溶液 附录B
猪肺泡巨噬细?PAM)制备、鉴定、保存与复苏
B1 试剂准备
B1.1 磷酸盐缓冲盐?PBS)
a)原液
氯化?NaCl) 8.00g;氯化?KCl) 0.20g;磷酸氢二?Na2HPO4) 1.15g;磷酸二氢?KH2PO4) 0.20g;溶于500mL三馏水中，再加入5mL0.4%酚红液，加三馏水?00mL?6kPa20min灭菌备用
)原液
氯化?MgCl2·6H2O) 0.1g;加三馏水 100mL;56kPa20min 灭菌备用;
c)原液
氯化?CaCl2)溶于100mL三馏水中?6kPa20min灭菌备用
c)工作
原液 8仼原液 1仼原液 1仼充分混合后备用。必要时，可适量加入抗生?青霉?03IU/mL、链霉素103μg/mL、庆大霉?03μg/mL)，不加制霉菌素
B1.2 细胞生长
?0%犊牛血清的RPMI1640营养?含青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL、庆大霉?0μg/mL)
B1.3 细胞冻存
取细胞生长液8.0mL，加入分析纯二甲基亚?DMSO)2.0mL，混合均匀。不加制霉菌素
B2 PAM的制
?~8周龄的SPF猪或被证实无PRRS病毒感染的健康猪，动脉放血致死后，立即无菌操作取出肺，切勿划破被膜。每次用?00mL PBS液从气管灌入肺，挤压灌洗3~4次，收集灌洗液，1000×g离心10min，得到的巨筮细胞泥用PBS液再悬浮和离心洗?~3次。最后的细胞泥用50mL细胞生长液悬浮，进行细胞计数，用细胞生长液稀释使用细胞浓度达4×107/1.5mL。所得新鲜巨噬细胞立即应用或定量分装后冻存
B3 PAM的冻
取细胞浓度为8×107/1.5mL的细胞悬液，加入等量细胞冻存液，缓慢滴加，边加边振摇。加毕，立即用聚苯乙烯管分装，每?.5/mL，放?0℃过夜，转入液氮中保存
液氮保存各批巨噬细胞，不可混合
B4 PAM的批次试
每批巨噬细胞应检验合格后再使用。方法是，在96孔细胞培养板上用已知滴度的标准病毒感染巨噬细胞，并用标准的阳性血清和阴性血清进行IPMA或IFA测定。只有能支持特定滴度的标准病毒良好生长的巨噬细胞，方可用于试验
B5 PAM的复
从液氮中取出冷冻细胞管，立即投入温水(38℃左?中迅速解冻。将细胞移入10倍量的RPMI1640营养?pH=7.2)中，1000×g离心10min，弃去上清液，沉淀的细胞用细胞生长液悬浮，计数，稀释至要求的细胞浓度后，即可使用
B6 IPMA诊断板的制备
用细胞分散液消化Marc-145或HS2H细胞，用细胞营养液稀释成5×104细胞/mL，加入PRRS美洲或欧洲标准毒，使其最终浓度为100TCID50/25μL，混合后接种96孔细胞培养板1??????0?1列的各孔内，每孔?00μL。在3???2列的各孔内加100μL未感染病毒细胞悬液。把细胞培养板放?7℃?%CO2培养箱中培养48h~72h.。当细胞出现20%CPE时，弃去培养液，用PBS?100μL/?洗一次，每孔?0%丙酮水溶?00μL，把板置?℃条件下固定30min。弃去丙酮液，在纸巾上拍干，放置室温下完全干燥后?0℃保存备用
B7 IFA诊断板的制备
用细胞分散液消化Marc-145或HS2H细胞，用细胞营养液稀释成5×104细胞/mL，加入PRRS标准毒，使其最终浓度为100TCID50/25μL，加?6孔细胞培养板???????0?1列各孔内，每?00μL。在3???2列各孔内加入未感染病毒细胞悬?00μL。将该细胞培养板?7℃?%二氧化碳培养箱中培养60h~68h。弃去培养液，每孔加入预冷的无水乙醇100μL，将此细胞培养板置于?0℃或?0℃冰箱中备用。 附寻C
猪繁殖和呼吸综合症病毒TCID50测定
C1 材料准备
C1.1 器材?8孔细胞培养板2块、微量移液器、恒温箱、倒置显微镜等
C1.2 病毒：美洲型标准株ATCC VR-2332或欧洲型标准株LV，向农业部指定单位索取
C1.3 细胞：MARC-145或HS2H传代细胞，向农业部指定单位索取。使用时，细胞经细胞分散液消化分散后计数，用EMEM营养?含犊牛血?0%、青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL，pH7.2)稀释至106细胞/mL
C2 操作方法
C2.1 稀释病毒：取洁净无菌?8孔细胞培养板，于?孔加EMEM营养?00μL，其余各孔加225μL;换吸头，再于排头?孔添加病毒液50μL，将混合液充分混匀。换吸头，吸?5μL移于?孔，混合。更换吸头，再吸?5μL加入?孔。连续如此操作至?0列，作成10个连?0倍的稀释液，使病毒稀释度依次?×100?×101?×102?×103?×104?×105?×106?×107?×108?×109。改用多头微量取样器吸取每一稀释度的病毒液50μL移入另一?8??6?细胞培养板，每个稀释度的病毒液平多移种4孔。剩下的各孔?0μFMEM营养液，留作细胞对照
C2.2 添加细胞：于细胞培养板各孔内添加50μL工作浓度的细胞悬液。此时，病毒稀释度依次变为101?02?03?04?05?06?07?08?09?010
C2.3 培养：封板后，放37?%二氧化碳保温恒温箱内培养
C3 观察与TCID50计算
在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作?CPE)。每天观察一次，并将观察结果记入专用登记表内。观察天数为直至出现CPE终点，即看到能够引起病毒增殖的病毒最高稀释度。对照细胞应始终保持良好形态和特征
用Reed-Muench法、内插法或Karber法计算该病毒培养物的TCID50/0.05mL
继前篇猪繁殖和呼吸综合症诊断方法补充
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