非洲猪瘟的爆发给世界带来了严重的公共安全问题，因此需要可靠的诊断工具来预防和控制疫情。在这里，我�?strong>成功地建立了一种便携式微流控环形荧光探针介导的等温核酸扩增（CFPA）系统，用于现场即时，快速，高通量，准确和灵敏地检测非洲猪瘟病毒。该检测系统的检测限�?0拷贝/μL，稳定性好（CV<5％），敏感性为92.73％，特异性为100%，同时，对采集的220头猪样本进行了非洲猪瘟病毒的检测，诊断时间阈值为10.8分钟、�/strong>这种新型的综合诊断工具对于监测和控制世界范围内的非洲猪瘟疫情，特别是在中国这种疫情严重的形势下，具有广阔的应用前景、�/p>

关键词：

非洲猪瘟病毒；等温核酸扩增；微流体；手持式检测设备；即时检浊�/p>

非洲猪瘟（ASF）的主要症状是高烧，出血和反应迟钝，是一种严重的动物疾病，死亡率几乎达到100％。ASF可以通过直接或间接接触在家猪中迅速传播，对养猪业和全球粮食安全构成重大威胁、�/p>

ASF在中国的此次暴发是由输入性感染引起的，分子分析表明，致病毒株属于p72基因II型和CD2v血清型。疫情给养猪业造成巨大的经济损失，并严重危害环境。为了应对这种紧急情况，迫切需要一种快速，高通量，简单，便携式且准确的ASFV现场检测方法，以帮助快速控制流行病并最大程度地减少损失、�/p>

迄今为止，现有的ASFV检测方法包括基于PCR的技术（例如RT-PCR）和基于等温扩增的技术的聚合酶交联螺旋反应（例如环介导的等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）））以及基于抗�?抗体反应的免疫学技术（例如酶联免疫吸附测定（ELISA）和侧向流动测定）、�/p>

尽管在过�?0年中取得了重大进展，但在使用这些方法时仍然遇到许多问题、�/p>

基于免疫的方法不如核酸检测方法灵敏，同时窗口期或hook效应的存在会导致漏诊。PCR方法更加灵敏，但是，这种方法需要专门的设备和训练有素的人员，而这在大多数养猪场中都是很难做到的、�/p>

等温扩增方法（如LAMP，NASBA，RCA）的便利性和对专用设备要求方面要优于经典PCR技术，但测定法存在非特异性扩增和假阳性现象，从而导致误诊、�/p>

这些方法的另一个局限性是低通量，这可能会限制它们在流行病监测时大规模筛选中的应用、�/p>

循环荧光探针介导等温核酸扩增(CFPA)是一种利用Bst DNA聚合酶和结构特异性核酸内切酶1(FEN1)进行特异性扩增和荧光信号释放的新型核酸检测方法，具有较高的灵敏度、特异性和可靠性、�/p>

这种方法在等温扩增中引入了一种新概念，即使用两种协同作用的酶。Bst酶负责延伸，扩增和链移位，而FEN1酶负责重组特定序列的结构以产生特定的荧光信号。更具体地说，双链DNA�?5℃左右处于动态平衡状态。当任一引物与双链DNA互补部分匹配时，另一条链将逐渐取代单链。在CFPA法中，每个探针的5’末端标记有荧光基团，靠近淬灭基团。首先，正向CFP与靶标相匹配并延伸，在链�?端带有淬灭荧光基团的一侧形成环形结构。然后，反向CFP匹配并扩增到该区域，形成重叠结构被FEN1裂解并释放出可检测的荧光信号、�/p>

这种新颖的设计可确保了高特异性信号的产生和高灵敏度的荧光检测，是一种很有前途的ASFV检测方法、�/p>

微流体技术可以将样品制备、分配和检测步骤集成到到具有微米级通道的芯片中，因此受到了科研人员广泛关注。该技术具有许多优势。首先，芯片中样品和试剂的数量很少，这大大降低了检测成本，是现场检测的理想选择。其次，可以在单个芯片上实现高通量检测。第三，它可以与多种检测技术一起使用，以分析多种类型的样本、�/p>

为了应对ASF在全球范围内的传播和近期ASF在中国的疫情爆发，我们建立了一个微流控CFPA系统，该系统包括离心微流控芯片、CFPA测定法和实时荧光检测设备，用于快速、准确地检测ASFV、�/p>

实验部分

CFPA系统的组成和浓度

芯片上单个CFPA反应的总体积为5 uL，将携带高度保守的ASFV序列的质粒作为检测标准。ASFV的高度保守序列是根据基因数据库中的大量序列比对得到的、�/p>

微流控芯片和配套的手持荧光检测设夆�/p>

本研究中使用的微流控芯片是采用微注射成型技术制备的，并采用热封膜形成集成微流控芯片、�/p>

构建的配套的手持式荧光检测设备需要实现三个核心功能：

1）恒温控制；

2）高速离心；

3）荧光读数和分析、�/p>

根据设计的功能要求，并考虑机械，电子设备和软件的实现可能性，我们将功能分解，然后将它们组合为一系列易于实现的模块。通过模块的组合，实现仪器的整体功能。设备的组成模块包括旋转模块、光学模块、温度控制模块、分析显示模块、电路电源模块和保护壳等、�/p>

评估微流体CFPA芯片的性能

通过对ASFV质粒样品进行连续稀释来评估微流控CFPA芯片方法的灵敏度� 其他六种易感染猪的病原体被用来评估本方法的特异性，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRPSV），伪狂犬病病毒（PRV），猪传染性胃肠炎病毒（TGEV），猪H1N1流感病毒 （H1N1），猪破伤风病毒（PTV）和猪链球菌（SSP）。这六种类型的临床样本均由上海海关动植物与食品检验检疫技术中心提供，并按照ASFV程序进行处理。对ASFV质粒和临床样品重复测�?次，以确定微流体CFPA芯片方法的稳定性和可重复性、�/p>

微流式CFPA检测与RT-PCR检测ASFV的比辂�/strong>

总共220头猪样本（包括全血和肌肉组织）用于评估我们的微流控CFPA芯片（该实验由国家外来病监测与研究中心和中国动物疾病预防控制中心的第三方独立操作人员完成）。这些样本是随机选择的，没有选择性偏差。将微流体CFPA芯片方法的诊断准确性与实时PCR试剂盒（由中国农业农村部批准）进行了比较，并通过生成受试工作曲线(ROCs，使用MedCalc统计软件)进一步评估诊断准确性。如果P值小�?.05，则认为测试为显著。还比较了两种方法（使用Mann-Whitney非参数检验，GraphPad Prism软件）达到每个阳性样品的阈值时间、�/p>

结果与讨讹�/h1>

微流�?CFPA芯片检测系统的设计与制速�/strong>

10分钟！便携式CFPA系统可即时检测非洲猪瘟病毒，中国动物卫生与流行病学中心和复旦大学联合研发

�? 环荧光探针介导等温核酸扩�?CFPA)的机刵�/p>

�?显示了CFPA方法所涉及的基本原理。该新方法利用两个特殊的环形荧光探针（通过在探针的5"端标记FAM荧光基团和在T碱基附近处标记TARMA淬灭基团，专门针对靶标的四个区域）与Bst 2.0热启动DNA聚合酶偶联，产生特殊的序列特异性重叠结构，然后被结构特异性核酸内切酶1（FEN1）识别和切割。在这一过程中，一个特定的荧光信号被释放，表明结果为阳性。该方法能够产生序列特异性荧光信号，具有较高的灵敏度和特异性，克服了其他等温扩增方法的不足。然后，开发并制造了离心微流控芯片（�?）、�/p>

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�? (A)微流控芯片平台示意图�?B)芯片的详细视图及其样品添加区、通道和反应区�?C)可供使用的微流体芯片照片�?D)手提式荧光探测设备的照片、�/p>

简而言之，该芯片由内外三个圆圈组成：内圈是添加了样品的样品孔；中间环是微流体通道，可将样品分成不同的微反应孔。外环是执行CFPA的反应池（图2A）。在一个芯片上可以同时分析八个样品，更具体地说，就是同时可以进�?2个反应，接近PCR的检测通量、�/p>

加载后，每个样品都通过离心力从芯片的中心到边缘，分成四个反应孔。四个反应孔包括两次重复的检测靶标（ASFV）的实验，一个用于阴性对照，另一个用于内源性阳性对照（来自猪基因组的持家基因）（图2B）。这种布置保证了最大的准确性、�/p>

只有当两次重复实验和内源性阳性对照显示阳性信号，阴性对照显示阴性信号时，才能判断输入样本为阳性、�/p>

该芯片可以达到高通量要求，并且检测快速简便。将与反应相关的环形荧光探针、引物、酶和缓冲液预装到反应孔中，然后操作员只需将提取的核酸添加到样品添加孔中，然后用密封膜将孔密封、�/p>

大多数商业快速核酸提取试剂盒都可以用来提取的核酸样品，例如固相提取或热裂解提取方法，可在五分钟内完成，而无需其他设备、�/p>

在这项工作中，我们使用了一种商业试剂盒，该试剂盒结合了微珠方法和chelex-100技术，可在五分钟内快速纯化核酸。此纯化过程需要金属浴和微量离心机，可以将其放入带有流动荧光检测装置的便携式检测套件中。上述核酸提取试剂盒具有微珠研磨功能，不需要额外的全血及肌肉组织提取、�/p>

另外，我们实验室还制作了一种便携式的微流体-CFPA荧光检测装置。该设备(尺寸:长、宽、高�?10×132×92 mm)操作简便，集离心、孵育、荧光检测于一�?具体设计及各模块组成见配套资�?。这种微流控核酸检测系统体积小，具有手持式的特点，更适合在现场检测，与以往的研究相比，这是一个重要的进步、�/p>

如图2D所示，设备顶部的圆形区域为芯片离心、孵育、放大反应区，设备下方的矩形区域为显示区域，可以实时监控CFPA反应的进程。对于CFPA反应，该装置可保持在63℃，并能记录每分钟每个孔的荧光值。在处理阳性样本时，显示屏上会观察到明显的 “S”扩增曲线，同时，系统会根据扩增曲线自动确定阳性样本并发出警报，从而，及时准确的提供疫情信息。如上所述，本研究提出的高通量、便捷的ASFV检测工具可以实现对该病毒病原体的快速、准确的流行监测。操作人员只需要从猪样品中提取核酸，将其添加到芯片上，然后将芯片放入便携式设备即可。在30分钟内自动读取结果、�/p>

这种手持式荧光检测装置与用于核酸纯化的金属浴和微量离心机相结合，都可以放置在锂电池供电的手提箱中，该手提箱具有出色的便携性并完全符合POCT的要求和功能、�/p>

由于猪的运输和饲料是ASF传播的重要手段，因此对这些过程的仔细监控以及对任何潜在感染源的及时控制对于控制疫情至关重要。这可以通过将我们的新检测系统与网络云技术结合使用来实现。在运输活猪之前，需要收集猪的血样以及有关卡车和驾驶员的信息。在芯片上检测后，如果检测到阳性样本，则可以将该信息自动上传到云数据库，从而向执法人员发出紧急警告，来定位并拦截相关车辆并切断感染源、�/p>

评价微流控CFPA芯片的性能

使用我们的新型微流控CFPA芯片系统地确定ASFV的诊断性能，最初我们使用了一个携带高度保守的ASFV基因的质粒来评估本实验的最低检测限、特异性和稳定性、�/p>

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�? 微流控CFPA芯片方法对ASFV的诊断性能�?A)�?C) 最低检测限的确定：（A）阳性对照质粒样品的连续稀释度�?06-0拷贝/uL），(B) 内源性阳性对照和 (C) 质粒浓度对数值间的线性关系和Tt值；(D) - (F)特异性分析：（D）ASFV阳性样品，（E）其他病原体作为阴性对照，以及（F）内源性阳性对照；使用高，中，低浓度质粒样品（G）和临床样品（H）进�?次重复实验的稳定性测试；(I) 8个重复实验中各Tt值的SD和C.V.、�/p>

�?A–C显示，该微流控芯片的最低检测限�?0个拷�?μL，并通过内源性对照和阴性对照验证了检测的完整性，如图3B所示。此外，质粒浓度的对数与Tt值之间存在显着的线性关系（p <0.05），这表明该新型诊断平台具有潜在的定量检测能力（�?C）。本实验的最低检测限与大多数等温核酸检测方法相比具有竞争力和可比性，保证了对ASFV感染的准确和快速鉴定、�/p>

�?D–F中显示的结果说明了我们方法的具有高度特异性，只有ASFV阳性样品显示出明显的扩增曲线（�?D），而其他六种常见猪病原体显示的是阴性结果（�?E）。以及阳性对照的预期结果（图3F）。稳定性也是诊断方法的重要指标、�/p>

�?G-1显示了我们的方法的稳定性，分别使用高浓度（105拷贝/uL），中等浓度�?03拷贝/uL）和低浓度（101拷贝/uL）质粒样品进�?次重复实验的评估之后，SD 值小并且 C.V. <5%。用真实的临床感染猪样品（图3H）获得的结果也支持了我们方法的检测稳定性、�/p>

综上所述，这些数据表明，微流控CFPA芯片方法是具有高灵敏度和特异性的ASFV的有前途的诊断工具。它是具有快速反应速度的手持式便携式设备，因此非常适合在现场监控ASFV感染和传播、�/p>

在检测实际临床样品中微流体CFPA芯片的性能

为了进一步验证微流控CFPA芯片在检测真实临床样品中的性能，我们在国家外来病监测与研究中心和中国动物疾病预防控制中心进行了220份真实猪样品（包括血液和组织样品）的实验，其中有165份样品的ASFV检测呈阳性，使用农业农村部批准的实时PCR试剂盒检�?5份样品呈阴性。微流体CFPA芯片方法的灵敏度和特异性分别为92.73％和100％（�?）、�/p>

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接下来，根据上述结果构建ROCs，来确定CFPA方法诊断的准确性。这表明微流控CFPA芯片方法能够区分ASFV感染和未感染的样品。其AUCROC�?.964；P<0.0001，Youden指数J�?.927，这表明它是一种有效的诊断工具（图4A）。当比较两种方法的AUCROC时，结果表明两种方法在诊断ASFV方面没有差异（Z=3.586，p<0.001，图4B）。这也表明微流控CFPA芯片方法具有准确的诊断能力，是PCR的理想替代方法、�/p>

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�? (A)微流�?CFPA芯片法诊断ASFV感染的受试者工作曲�?ROC)分析�?B) 使用ROC

此外，微流控CFPA芯片方法的操作时间比其他诊断方法短得多，这对于快速检测和及时响应至关重要。在检测ASFV感染的样品时，将我们的方法的Tt值与RT-PCR进行了比较，微流控CFPA芯片和RT-PCR方法的中位阳性时间分别为10.8�?1.4分钟（图5；p<0.0001）。此外，在整个检测过程中，考虑到核酸提取和确定阴性的时间，我们的方法和PCR分别需�?0�?0分钟左右。这些发现进一步证明了微流控CFPA芯片方法的快速检测能力，能够及时，准确地获得疫情信息、�/p>

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�? 微流�? CFPA芯片法与RT-PCR法诊断ASFV感染猪标本的时间阈值比辂�/p>

结论

综上所述，本研究成功建立了一种新型的ASFV诊断工具，该诊断工具集合了微流控芯片、实验室设计的新型CFPA方法和自制的手持式便携式微流控芯片荧光检测仪。该设备体积小，简单，通量高，并且易于在现场使用。事实证明，这种新的诊断工具具有很高的灵敏度，特异性，良好的稳定性和快速的反应速度。这些特征表明该方法在ASFV疫情监测和控制中具有非常好的应用前景。同时，这种新的核酸检测平台在检测其他类型的核酸靶标（如其他传染性病原体和疾病遗传标记）方面也具有广阔的应用前景、�/p>

文章信息９�/p>

10分钟！便携式CFPA系统可即时检测非洲猪瘟病毒，中国动物卫生与流行病学中心和复旦大学联合研发

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