猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)是猪传染性萎缩性鼻?Swine infectious atrophicrhinitis of Swine，简称AR)的主要病原菌，单独或与产毒素多杀性巴氏杆菌混合感染可引起猪的非进行性及进行性萎缩性鼻炎。该病在世界范围内存在，给养猪业造成巨大的经济损失、/p>
1、病原特?/p>
支气管败血波氏杆菌属于波氏杆菌属细菌，是一种无芽孢、单在或成对排列的革兰氏阴性球状杆菌，常呈两极着色，其大小为0???m0???m。同时是一种严格需氧、非氧化非发酵型细菌。根据毒力、生长特性和抗原性，该菌可分?个菌相，I相菌的病原性最强，有荚膜和密集周生菌毛。II相菌和III相菌无荚膜和菌毛，毒力较弱。在实验传代过程中，细菌易发生菌相变异，由I相菌变成II相菌和III相菌，II相菌是I相菌和III相菌之间的过渡菌型、/p>
Bb固着在鼻腔黏膜上皮细胞上增殖，其坏死毒素引起鼻腔上皮发炎、增生和退变导致黏膜受损，给产毒素多杀性巴氏杆?toxigenic Pasteurella multocida，TPm)寄居和增殖创造了条件。除引起猪鼻甲骨萎缩外，还可引起猪的支气管性肺炎。Bb除感染猪外，还可感染家兔、豚鼠、马、大鼠、狗、猫等多种哺乳动物，偶尔感染人，引起慢性呼吸系统疾病或支气管肺炎、/p>
2 、Bb的分离鉴宙/p>
Bb的分离及鉴定方法包括病原学方法、血清学方法和分子生物学方法3种。虽然细菌分离鉴定是病原学方法中最基础、最传统的方法，由于鼻腔中其他常在菌的干扰，同时该菌在培养过程中容易发生菌相变异，实际工作中Bb的分离培养十分困难、/p>
2?病原学方泔/p>
2?? Bb的分离培兺/p>
对表现萎缩性鼻炎临床症状的猪，消毒猪鼻盘后，用棉拭子采集猪鼻腔内黏性分泌物，将棉试子样本保存在4?℃的非营养性转运培养基中。对剖检发现有肺部病变的猪，无菌取肺组织样本，保存在4?℃条件下尽快转运至实验室。Bb在各种普通培养基中均易生长，如常用的商业化培养基胰蛋白酶大豆琼脂(tryptic soy agar，TSA)、麦康凯琼脂、鲍一?Bordet-Gengou)氏培养基等，但容易发生菌相变异。通常用来培养I相菌的条件为：在鲍一姜氏基础培养基中加入5％～l0％的血液或裂解红血球液及优质混合蛋白胨，并在无凝集水的潮湿空气?7℃培?4?8 h。典型的Bb I相菌呈圆形、高度凸起、光滑、直径小于l mm、半透明、边缘整齐，强黏性的菌落，而菌相变异菌呈扁平或低凸起、粗糙、直径大? mm、透明、边缘不整齐，无或弱黏性的菌落；在鲜血琼脂培养基上I相菌?溶血，而菌相变异菌呈y溶血。同时，Bb I相菌?％葡萄糖改良麦康凯平板菌落不变红，可生长出一种圆形光滑、闪光隆起、透明略呈茶色或茶黄色的菌落。但该方法的优点是操作简便缺点是培养基营养丰富，无抗菌剂，易受常在菌污染、/p>
苏雄等利用自行设计的双层平板选择培养基并用双温培养法分离猪Bb。用加有l％葡萄糖的麦康凯琼脂作为基础培养基，病料接种后在37℃培养一段时间，再在该培养过的基础平板上倾注一层半固体培养基，?5℃培?4?6 h，其后在培养基表面挑选单个的菌落进行验证。该方法的优点是能抑制其他污染杂菌和真菌的生长，不需要抗菌剂，但培养基配置和培养繁琐，在临床上很难推广、/p>
杨佩琼比较了改良Smith培养基、l％葡萄糖麦康凯培养基和呋喃西林麦康凯培养基对Bb作分离效果，发现改良的Smith培养基的分离培养效果最理想，能很好地抑制鼻腔中其他细菌的生长，并使培养基pH改变导致颜色变化，出现浅蓝绿色、边缘有光泽、易于识别的菌落、/p>
2?? Bb的染色及镜检
挑取直径l mm左右、半透明、光滑、湿润的典型菌落进行革兰氏染色，将革兰氏阴性、两极着色、散在或成对排列、呈细小球杆状菌的菌落定为可疑菌落。对可疑菌落进行传代纯化，用于继续鉴定。也可以将病料或初代分离的细菌接种小鼠，对死亡小鼠剖检，取心血分离鉴定细菌，以提高菌株的分离率和毒力、/p>
2?? Bb的生化鉴宙/p>
Bb的特征性生化反应包括氧化／发酵(O／F)、葡萄糖磷酸盐胨?MR、VP肉汤)、西蒙氏枸橼酸钠、葡萄糖、乳糖、吲哚、硫化氢、硝酸盐还原、尿素、触酶和氧化酶、液化明胶等。将Bb接种于上述生化反应管中，Bb尿素酶试验阳性?能利用柠檬酸盐、还原硝酸盐、不产生靛基质、不产生硫化氢、MR和VP试验均为阴性、不液化明胶，不氧化也不发酵包括葡萄糖在内的所有糖、/p>
2?? Bb的致病性实骋/p>
对分离的Bb需进行动物致病性实验以确定其毒力和致病性。实验动物可以为小鼠、豚鼠或猪。将Bb分离株通过气管注射和滴鼻途径接种30日龄仔猪进行感染试验，接种猪出现呼吸系统症状，采集感染猪鼻拭子，进一步分离鉴定Bb。陈武森等选用豚鼠作为实验动物，将临床分离的致病波氏杆菌I相菌的肉汤培养物通过腹腔注射，解剖观察有皮下、肠、肝、心出血，伴有腹水、胆囊肿大等病变，随后从死亡豚鼠组织中分离鉴定细菌、/p>
2? Bb的血清学鉴定
Bb的血清学鉴定方法包括使用Bb标准阳性血清和Bb的O(菌体抗原)、K(荚膜抗原)因子抗血清作平板凝集实验。将Bb分离菌株?4 h培养物分别与Bb标准阳性血清混合，如产生凝集反应而与阴性对照血清无反应者为Bb、/p>
Bb具有由荚膜抗原和菌毛抗原组成的K抗原和菌体O抗原，故可以使用Bb O、K因子抗血清作平板凝集实验。Bb I相菌表面K抗原将菌体O抗原完全遮闭，因此它只能与抗K因子血清发生凝集反应。III相菌不具有表面K抗原，只有菌体O抗原，因此它只能与抗O因子血清发生凝集反应。II相菌介于I相菌和III相菌之间，具有表面K抗原，但不能将菌体O抗原全部遮闭，因此它与K因子血清和O因子血清均能发生凝集反应、/p>
2? Bb的分子生物学鉴定方法
关于Bb分子机制等方面的研究已经较为深入，然而关于Bb检测方法的报道却很少。仅有利用核糖分型法、脉冲凝胶电泳法和限制性酶切分析法来检测Bb的报道，然而这些方法都是用于区分不同宿主间Bb的同源性，并不适合于临床诊断。现今用于支气管败血波氏杆菌的分子生物学鉴定方法包括菌落杂交分析法和PCR法、br /> 2??菌落杂交分析法鉴定Bb
美国Register等应用双色杂交法同时检测Bb和TPm。通过双荧光标记的抗体可以同时杂交4700 bp的BbalcA基因和大小l 200 bp的T+Pm toxA基因探针，alcA为地高辛标记，杂交后有Bb存在处显粉红色，取样3 d后即可获得结果。检测表现AR临床症状?4份鼻拭子样品，检测结果与其他常规鉴定方法对比有极高的敏感性和特异性，而且该法是一种菌落杂交分析法，鉴定细菌从初级培养物中的单一菌落挑选，不需要对受检细菌进行纯代培养，但是操作过程复杂，需要专门的研究技术人员才能完成。因此，该方法的普遍利用还有一定的局限性、/p>
2?? PCR方法检测Bb
Hozbor等针对Bb鞭毛基因的上游序列设计的引物建立了PCR的检测方法，该方法可以扩增出Bb特异性的大小?37 bp的片段，并能够和百日咳波氏杆?B．pertussis)及副百日咳波氏杆?B．psrapertussis)区别开。且细菌只需要经过初代培养即可作为PCR的模板使用，该法具有很好的特异性和敏感性，细菌量少于l0个的样本也可以直接检出。国内鲁承等利用多重PCR方法可以同时鉴定Bb和T+Pm感染。使用PCR方法不需做目的菌的分离培养，在高浓度的目的菌存在时，不必做增菌培养，可直接从所采取的鼻腔分泌物中分离DNA应用于检测，并且不必考虑杂菌的过度增殖，为临床上确定猪传染性萎缩性鼻炎病原菌感染建立了新途径。杨咏洁等证实PCR检测的检出率是细菌检查法??5倍，是微量凝集法??5倍，具有较好的特异性和敏感性、/p>
综上所述，猪源支气管败血波氏杆菌是猪的重要病原菌，现有的分离鉴定方法均存在实验条件要求高、操作繁琐等缺点，亟需开发更多灵敏性高、特异性好、可在现场使用的快速诊断方法、/p>