发酵饲料对南美白对虾消化酶活性与肠道菌群的影�

导读

南美白对虾学名凡纳滨对虾, 生长速度快、营养价值高、投报率�? 是我国重要的养殖品种之一。但是随着南美白对虾养殖的迅猛发展, 病害问题日益突出, 日渐污染的环�? 同样威胁着养殖对虾的安�? 抗生素的使用, 不但扰乱了对虾消化道的正常菌�? 使病原菌产生抗药�? 药物在环境和对虾体内的残留最终威胁人类的健康与安�? 已引起人们的广泛关注, 一些学者将活的微生物添加到饲料�? 通过改善肠道菌群平衡, 而对动物产生有益影响。但�? 南美白对虾饲料加工过程中有高温熟化的过程, 意味着添加的益生菌为抗高温的芽孢杆�? 而对虾的消化道短, 大部分芽孢杆菌的芽孢经过对虾肠道时未来得及萌发就排出体外, 致使其应用效果受到限制。对�? 开发高效益生菌投喂技�? 提高益生菌的养殖效果具有重要实践意义、�/p>

发酵饲料是以微生物为生物饲料发酵菌种, 将饲料蛋白质转化为微生物菌体蛋白、生物活性小肽类氨基酸、微生物活性益生菌为一体的生物发酵饲料, 同时还可以去除饲料中的抗营养因子, 在畜禽养殖上广泛应用。鉴于此, 我们通过将复合益生菌与饲料混合发�? 探讨发酵饲料对南美白对虾生长、消化酶活性和肠道菌群的影�? 为发酵饲料的广泛应用提供理论依据、�/p>

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材料与方泔�/strong>

1.1 实验材料

1.1.1 对虾和菌秌�/strong>

南美白对虾来自天津鑫永丰水产养殖有限公司, 规格 (4.16±0.56) g, 产朊假丝酵母菌、植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心、�/p>

1.1.2 实验仪器

立式双层小容量恒温培养摇�? 上海新苗医疗器械制造有限公号�全温型多振幅轨道摇床, 上海智城分析仪器制造有限公号�立式蒸汽灭菌�? 上海博迅实业有限公司医疗设备厁�PCR扩增�? 美国伯乐公司;高速冷冻离心机, 湖南湘仪离心机仪器有限公号�生物显微�? 麦克奥迪实业集团有限公司;精密pH�? 天津市盛邦科学仪器技术公号�CO₂培养�? 美国Thermo公司;电子分析天平, 梅特�?托利多公� (瑞士) 、�/p>

1.1.3 基础饲料

基础饲料为自行配�? 配方见表1。饲料原料经粉碎后过80目筛, 各原料按配比定量后混合均匀, 然后加入适量的水揉匀, 经双螺杆挤条机挤压出直径�?.0 mm粒径的饲�? 60℃烘干后剪切�?.2 mm长的颗粒贮存备用、�/p>

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计

本实验设�?个发酵饲料组�?个对照组, 每组�?个平�? 共计6个处理。水族箱规格720 mm×490 mm×380 mm, 每个水族箱中投放40只对虾、�/p>

1.2.2 发酵饲料制备

将地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌和产朊假丝酵母分别扩大培�? 细菌数量分别�?.2×10⁹�?.5×10⁹cfu/ml�?.6×10⁹cfu/ml, 然后按照体积�?�?�?混合, 混合菌液中加入红� (2 g/1 000 ml) 和自来水, 菌种液与水的比例�?.80, 混合均匀, 与对虾饲�? 按照2.5的比例搅拌均匀, 塑料薄膜密封发酵24 h, 制成发酵饲料、�/p>

1.2.3 饲养管理

饲养期间, 投饵量按照对虾体重的4%~6%进行投喂, 每天投喂4�? 投喂时间:6:00�?1:00�?6:00�?1:00, 各时间点投喂量占日总投饵量的比值分别为30%�?0%�?0%�?0%。饲养期间连续充�? 水温27~29�? 盐度18~20, pH�?.8~8.1, 溶解�?6 mg/l。饲养时间为6周、�/p>

1.2.4 指标测定

1.2.4. 1 对虾生物学指栆�/strong>

6周养殖结�? 分别测定对虾的体长和体质�? 计算对虾的特定生长率、�/p>

特定生长� (%/d, SGR) =100× (L_nM_t-L_nM_o) /t

式中:M_o和M_t——分别为初始体质量和终末体质� (g) ;

t——试验天� (d) 、�/p>

1.2.4. 2 消化酶活�?/strong>

(1) 样品处理

解剖南美白对�? 取出胃、肝胰腺和肠�? 去除肠道的内容物并且在滤纸上将表面的水分吸干, 所有操作均在冰浴中进行。分别称取适量肠道、胃及肝胰腺样品, 加入9倍体积预冷的生理盐水匀�? 8 000 r/min�?℃离�?0 min, 取上清液, 4℃备用、�/p>

(2) 胃蛋白酶

1.0%牛血红蛋�?0.1 mol/l柠檬酸缓冲液 (pH�?.0) 1 ml, 0.04 mol/l EDTA-Na₂0.05 ml, 0.2 mol/l柠檬酸缓冲液 (pH�?.0) 0.2 ml, 酶粗提液0.1 ml, 置于37℃水浴中, 反应15 min后加�?0%三氯乙酸0.5 ml (空白在加入三氯乙酸后再加入酶粗提�? , 8 000 r/min离心4 min, 取上清液1 ml, 加入0.5 mol/l NaOH 2.5 ml, Folin试剂0.25 ml, 混匀, 37℃水浴显�?5 min�?80 nm波长测吸光值。胃蛋白酶活性用活力单位 (U) 表示, �? mg蛋白的酶液每分钟水解牛血红蛋白产�?μg酪氨酸为1个酶活力单位、�/p>

(3) 蛋白酵�/strong>

2%干酪�?0.1 mol/l磷酸盐缓冲液 (pH�?.2) 1 ml, 酶粗提液1 ml, 置于37℃水浴中, 反应15 min后加�?0%三氯乙酸0.5 ml (空白在加入三氯乙酸后再加入酶粗提�? , 8 000 r/min离心4 min, 取上清液1 ml, 加入0.4 mol/l Na₂CO₃5 ml, 稀释的Folin试剂 (与蒸馏水1�?稀�? 1 ml, 混匀, 37℃水浴显�?5 min�?80 nm波长测吸光值。蛋白酶活性用活力单位 (U) 表示, �? mg蛋白的酶液每分钟水解干酪素产�?μg酪氨酸为1个酶活力单位、�/p>

(4) 淀粉酶

1 ml 1.0%可溶性淀�?0.1 mol/l磷酸盐缓冲液 (pH�?.0) , 加酶粗提�?.1 ml, 37℃水浴反�? min, 加入DNS (3, 5-二硝基水杨酸) 显色�?.0 ml (空白在加入DNS后再加入酶粗提液) , 煮沸10 min终止反应, 540 nm波长测吸光值。淀粉酶活性用活力单位 (U) 表示, �? mg蛋白的酶液每分钟水解淀粉产�? mg葡萄糖为1个酶活力单位、�/p>

(5) 脂肪酵�/strong>

5 ml 0.025 mol/l磷酸缓冲� (pH�?.5) 加入4 ml聚乙烯醇橄榄油乳化液, �?0℃水浴中预热10 min, 然后加入酶粗提液0.5 ml, 40℃保�?0 min, 立即加入95%乙醇15 ml终止反应。加酚酞指示�?�? �?.05 mol/l标准NaOH滴定至微红色, 并同时做空白对照。脂肪酶活性用活力单位 (U) 表示, �? mg蛋白的酶液每分钟催化脂肪产生1μmol脂肪酸为1个酶活力单位、�/p>

1.2.5 肠道菌群分析

解剖取出对虾肠道, 无菌水清�? -20℃保�? 送至北京诺禾致源科技股份有限公司测序。根据所扩增�?6S区域特点, 基于Illumina HiSeq测序平台, 利用双末端测� (Paired-End) 的方�? 构建小片段文库进行双末端测序。对Reads拼接过滤, 得到有效数据 (Clean Data) , 对OTUs (Operational Taxonomic Units) 聚类, 进行物种丰度、�?多样性计�? 挖掘不同处理组之间的差异、�/p>

1.2.6 数据处理与分枏�/strong>

各处理组数据进行单因素方差分析。分析软件为SPSS 17.0, 实验数据均以“平均值±标准差 (Mean±SD) ”表示、�/p>

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结果与分枏�/strong>

2.1 发酵饲料对南美白对虾特定生长率的影响 (见图1)

发酵饲料投喂的南美白对虾特定生长率高于对照饲�? 但未达显著性水� (P>0.05) , 可见饲料经过发酵�? 能够提高南美白对虾生长性能、�/p>

2.2 发酵饲料对南美白对虾消化酶活性的影响

不同处理组南美白对虾胃、肝胰腺和肠道的消化酶活性测定结果见�?、表2、表3、表4。发酵饲料能够显著或极显著提高南美白对虾胃、肝胰腺和肠道中胃蛋白酶活� (P<0.05戕�em>P<0.01) , 极显著提高南美白对虾肠道中蛋白酶活� (P<0.01) , 显著或极显著提高南美白对虾肝胰腺及肠道中淀粉酶活� (P<0.05戕�em>P<0.01) , 显著提高南美白对虾肝胰腺和肠道中脂肪酶活� (P<0.05) , 提高其他组织器官中消化酶活�? 但未达显著性差� (P>0.05) 、�/p>

2.3 发酵饲料对南美白对虾肠道菌群的影哌�/strong>

基于Illumina HiSeq测序平台, 不同处理组南美白对虾肠道菌群分析结果见图2、图3及表5, 其中对照组用Control表示, 发酵饲料组用FD表示、�/p>

2.3.1 OTU聚类及物种注释情冴�/strong>

对发酵饲料组和对照组南美白对虾肠道中的OTU聚类和注释结果进行了综合统计, 结果见图2。发酵饲料组南美白对虾肠道共得到86 176条Tags, 1 470个OTUs, 对照组为82 084条Tags, 1 090个OTUs, 可见饲喂发酵饲料�? 肠道菌群种类数明显增加、�/p>

2.3.2 物种相对丰度展示

根据物种注释结果, 选取每个样品在各分类水平 (Phylum、Class、Order、Family、Genus) 上最大丰度排名前10的物�? 生成物种相对丰度柱形累加�? 以便直观查看各样品在不同分类水平�? 相对丰度较高的物种及其比例。以门水平物种相对丰度柱形图为例展示如图3。对每个样品的物种分类结�? 筛选特别关注的物种 (默认选择最大相对丰度前10的属) 进行物种分类树统计。与对照组相�? 发酵饲料组南美白对虾肠道中的软壁菌门 (Tenericutes) 相对丰度 (Relative Abundance) 明显增多 (58.133%增加�?0.04%) , 拟杆菌门 (Bacteroidetes) 相对丰度增加 (2.251%增加�?.71%) , 放线菌门 (Actinobacteria) 明显增多 (0.375%增加�?.45%) , 变形菌门 (Proteobacteria) 明显减少 (24.10%减小�?0.002%) , 厚壁菌门明显减小 (�?.69%减小�?.236%) , 疣微菌门 (Verrucomicrobia) 明显减少, 酸杆菌门 (Acidobacteria) 明显增多。尽管发酵饲料组对虾肠道中厚壁菌门相对丰度减� (�?.69%减小�?.236%) , 但是芽孢杆菌纲相对丰度增� (�?.147%增加�?.38%) , 乳杆菌属相对丰度增加 (�?.147%增加�?.38%) , 其中植物乳杆菌由0.001%增加�?.01%。可见发酵饲料能够改变对虾肠道菌群组�? 尤其提高了植物乳杆菌的相对丰度、�/p>

2.3.3 α-多样性指�?/strong>

一般来�? �?7%以上的序列一致性下聚类成为一个OTU的序列被认为可能是源自于同一个种的序列。因�? 对不同样品在97%一致性阈值下的�?多样性分析指数进行统�? 见表5。发酵饲料组的南美白对虾肠道菌群的香�?威纳指数、辛普森指数、chao1指数、ACE指数、测序深度指数、谱系多样性指数均明显高于对照�? 进一步说明发酵饲料投喂的对虾肠道菌群多样性较好、�/p>

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� 讹�/strong>

3.1 南美白对虾的消化酵�/strong>

甲壳动物消化酶的活性与其食性、发育阶段、营养、温度、pH值、盐度等诸因素密切相�? 并同时受到内因和外因的调控。对甲壳动物消化酶学的深入理�? 有助于了解甲壳动物消化生理状�? 有效提高饲料的消化利用率, 减轻对环境的污染。黄凯等研究了盐� (1�?5�?0) 对凡纳滨对虾幼虾消化酶活性的影响, 指出当盐度为1�? 胃肠中的胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶及肝胰腺中的胃蛋白酶活性最�? 各盐度组的肝胰腺淀粉酶活性很接近;盐度显著影响凡纳滨对虾肝胰腺中胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活�? 随着盐度增加, 消化酶活力均不断下降。刘明等研究后指�? 0.3%�?.5%�?.0%酵母培养物显著提高南美白对虾肝胰腺蛋白酶活�?南美白对虾胃、肝胰脏和肠道脂肪酶的最适温度分别为50�?0�?0�? 淀粉酶的最适温度均�?0�? 蛋白酶的最适pH值分别为6.0�?.0�?.5, 脂肪酶的最适pH值均�?.0, 淀粉酶的最适pH值分别为6.0�?.0�?.5。南美白对虾胃蛋白酶和类胰蛋白酶活力从Z1到M3期逐渐增大, 淀粉酶和纤维素酶活力呈逐渐下降趋势, 脂肪酶活力很�? 在食性转化过程中, 胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活力呈现较明显的变化, 南美白对虾幼体消化酶对饵料中的营养物质有着明显的适应性。乳酸菌能够显著提高凡纳滨对虾肝胰腺和肠道中的淀粉酶和脂肪酶活力及肠道中的蛋白酶活力。我们经过研究发�? 发酵饲料能够显著提高南美白对虾胃、肝胰腺和肠道中胃蛋白酶活�? 显著提高对虾肠道中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性及肝胰腺中的淀粉酶和脂肪酶活性、�/p>

3.2 南美白对虾的肠道菌群

沙玉杰采用Illumina Miseq高通量测序技术分析了凡纳滨对虾肠道中的细菌组�? 发现变形菌、疣微菌和放线菌是各个处理组中的优势菌群, 但各个处理组中均存在其特有的细菌种类, 并且饲料中添加乳酸菌发酵上清液后, 显著增加了对虾肠道中放线菌的丰度。以类芽孢杆菌和双歧杆菌为益生菌, 添加到凡纳滨对虾饲料�? 明显改善对虾肠道的菌群组�? 芽孢杆菌和中草药制剂也改变了凡纳滨对虾肠道菌群的数量与组成、�/p>

本研究发�? 软壁菌、变形菌、拟杆菌和厚壁菌是对照组和发酵饲料组南美白对虾肠道中的优势菌�? 各个处理组中也存在其特有的细菌种�? 发酵饲料能够明显增加软壁菌、放线菌、酸杆菌和拟杆菌的丰�? 尤其提高了植物乳杆菌的相对丰度。可�? 饲料经过发酵后投喂对�? 明显改善了对虾肠道的菌群组成、�/p>