新型猪瘟疫苗研究进展报告

猪瘟 (Classical swine fever� CSF)是一种高度接触� 传染� ，对养猪业危害极大，其病� 猪瘟 病毒 (Classical swine fever virus，CSFV)为单股正链RNA 病毒 ，属于黄病毒�?Flaviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，研究证明，猪瘟病毒的抗原蛋白主要是Erns、E1、E2�?0世纪70年代后期，猪瘟的流行形式发生了很大变化，地区散发性流行及非典型猪瘟症状的发生，表明猪瘟病毒的抗原性可能存在着变异，特别是近年来国内外应用单克隆抗体对C株检测时发现有不同的反应模式，猪瘟兔化弱毒疫苗免疫失败也有报道，提示随着传代次数的增加和对不同细胞的适应� 繁殖 ，疫苗毒株可能发生异质性或抗原漂移。加之数十年来猪瘟病毒在大规模免疫接种压力下出现抗原变异，现有的传统疫苗已不能完全适应新形势的需要，研究和开发新型猪瘟疫苗成为大势所趋，而分子生物学技术的发展，为新型猪瘟疫苗的研究和开发奠定了基础 �

猪瘟病毒基因缺失型弱毒疫�

病毒编码毒力的基因可以删除，当某些与病毒复制无关的毒力基因缺失突变后，病毒毒力丧失或明显减弱，但病毒复制能力并不丧失，同时还保持着良好的免疫原性，因此，通过基因工程技术使病毒基因组中的毒力基因缺失，可以获得基因缺失型弱毒疫苗株�

Widjojoatmodjo M N� 建立了能够表达猪瘟病毒糖蛋白Erns的细胞系SK6c26，构建了两个Erns缺失突变株Flc23和Flc22，经检测证明SK6c26所产生的Erns蛋白和其他猪瘟病毒Erns蛋白具有相同的生化特性，分别用两个突变株免疫试验猪，均可抵抗致死量猪瘟病毒Brescia株强毒的攻击，而且Erns的缺失可用于感染猪和免疫猪的鉴别。Gennip H G� 构建�?个E2基因缺失的感染性DNA，这3个缺失突变均不能产生活病毒，表明E2的每一个抗原区对猪瘟病毒的生存都是必要的，这些缺失突变株接种猪后，均会产生不同程度的免疫作用，并且用血清学试验可以区别于正常毒株，说明基因缺失型弱毒疫苗可能是发展猪瘟标记疫苗的有效途径之一�

猪瘟病毒亚单位疫�

亚单位疫苗是从病毒粒子中分离出的保护性抗原，这种抗原是病毒粒子的一部分，不含有核酸，因此非常安全，但是亚单位疫苗的免疫原性通常较低，需要与佐剂合用，或偶联到适当的载体上应用。从完整病毒粒子上制备具有免疫原性的亚单位疫苗，往往过程复杂，成本较高。而采用基因工程方法，克隆得到编码病毒保护性抗原基因，在体外对其进行改造或修饰后，重新转移到异源生物宿主体内或培养细胞中，可使病毒蛋白获得大量表达。利用真核细胞高效表达系统来表达猪瘟病毒免疫原蛋白，并以此作为抗原可获得猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗�

对猪瘟病毒编码蛋白的功能研究表明，囊膜糖蛋白E2是其主要的保护性抗原蛋白，E2蛋白单独免疫即可保护猪不� 生猪 瘟，而且E2蛋白上的中和表位在猪瘟病毒毒株中是保守的 。这样，在E2蛋白基础上开发的亚单位疫苗不仅会赋予对抗CSFV野毒株的广泛保护，而且很容易通过检测抗Erns的抗体将免疫的和感染的猪区分开 5]。Moormann R J� 6]已分别在猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2和Erns的基础上尝试开发出猪瘟的亚单位标记疫苗及与之相配套的诊断试验，初步的检验结果显示，这种E2疫苗和配套的诊断试验具有较好的效果。试验证明，E2亚单位疫苗接种后10 d可完全预防猪瘟的发生 7]。将猪瘟病毒E2基因cDNA重组入核型多角体病毒(AcNPV)，并在sf21细胞中表达，�?0 μg�?00 μg的表达蛋白免疫猪，可抵抗100×LD50的猪瘟强毒攻击，其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水� 8]。Klinkenberg等均对E2基因亚单位疫苗进行了效力试验，证明其对猪有良好的保护作用，但是不能有效地防止猪瘟病毒的传播，说明虽然猪瘟病毒亚单位疫苗安全性较高，但其保护效力有待进一步提高�

有两种含有病毒糖蛋白E2的亚单位疫苗正在接受详细的审查，E2蛋白基因均是与杆状病毒重组后在昆虫细胞中进行表达� 9]。杆状病�?shy;昆虫细胞系统可高水平表达外源蛋白，蛋白加工过程中，细胞能够进行糖基化修饰，所得到的病毒糖蛋白被以一种“天然”的方式表达，所表达的蛋白“仿真度”较高，因此成为众多亚单位疫苗研究的工具。由于基因工程亚单位疫苗技术具有安全、稳定、可规模化生产等优点，同时又可根据流行毒株的变化更换合适的猪瘟病毒抗原基因，因此具有广阔的应用前景�

猪瘟病毒活载体重组疫�

病毒基因组的某一核苷酸序列被切除、突变或在该区域内插入外源性基因片段，而不影响病毒的复制，这一序列称为病毒的复制非必需区。利用基因工程的方法将复制非必需区克隆出来，体外改造后再将异源性病毒的保护性抗原基因及启动子调控序列插入其中，通过体内同源重组技术获得重组病毒，利用该重组病毒接种动物，不仅可以诱导机体产生针对异源性病毒的特异性免疫反应，而且能够使宿主获得针对载体病毒的免疫力。基于这种原理，人们试图构建猪瘟病毒的活载体重组疫苗。Rumenaph T� 10]首次把猪瘟病毒的结构蛋白基因插入痘苗病毒的胸苷激�?TK)基因，构建了3个重组痘苗病毒，即VACcore、VAC3.8(core＋Erns＋E1＋E2)和VAC3.8]4　猪瘟病毒核酸疫苗

核酸疫苗是指注入动物体内后能够诱导机体产生免疫反应的重组表达质粒，以配有原核复制组件和真核表达调控组件的质粒为载体，将免疫原基因插入该质粒中，用裸核酸接种动物即可产生免疫保护�

核酸疫苗是近年来兴起的一种新的疫苗，在猪瘟疫苗研制领域也取得了一些可喜的成果。Markowska D I� 1 对猪瘟病毒核酸疫苗进行了测试，经临床观察证明，可以抵抗强毒攻击，但是会出�?0 ℃以上的高烧，免疫后可以检测出轻微的T、B细胞反应。余兴龙等分别构建了包含猪瘟病毒E2基因的重组表达质粒，并且证明它们对猪有较好的保护作用 1517]。周鹏程� 18]用构建的真核表达质粒pcE2肌肉接种小鼠可诱导产生CSFV中和抗体�

重组质粒可通过发酵培养方式大量制备，又具有相对较好的稳定性，并且大容量的质粒还可同时容纳多种病毒的免疫原基因，因此，这项制苗技术具有很大的研究价值。核酸疫苗免疫的最大优点是可以在同一时间，通过质粒携带的编码不同病毒抗原基因进行免疫，若同时将编码细胞因子的基因插在质粒上，不但可以提高免疫反应，而且可以调整反应从Th1型向Th2型过� 19]。这样通过使用合适的启动子、细胞因子和载体，不但可以产生终身免疫，还可以调控免疫反应的类型。因此，核酸疫苗的研究对于新型非复制型疫苗预防猪瘟具有十分重要的意义�

猪瘟病毒全长感染性cDNA标记疫苗

全长cDNA标记疫苗是在分子水平上，将具有选择性标记的基因，替换或克隆到致弱病毒全长cDNA中，获得了重组病毒。以重组病毒接种动物后，可以区分抗体来自于自然感染还是标记疫苗免疫，从而鉴别出感染猪群和免疫猪群，标记疫苗的开发有可能成为猪瘟疫苗发展的一个主要方� 20]�

Moser C� 2 将编码细胞氯霉素乙酰转移�?chloramphenicol acethl transferase，CAT)基因插入到猪瘟病毒Alfort/187株全长cDNA克隆pA1871的Npro基因中，经检测，在感染细胞中产生的融合蛋白CATPro保留了CAT和Npro二者的酶活性，重组病毒的CAT基因在病毒传�?0代后依然保持稳定。De Smit A J 2 将猪瘟病毒疫苗株的E2和Erns部分序列分别用牛病毒性腹泻病�?Bovine viral diarrhea virus� BVDV)相应区段替换，构建了两个镶嵌病毒(Flc2、Flc3)，在免疫接种1周～2周后，即可对猪产生较好的保护作用，检测结果还显示，重组病毒在兔和猪中均保留了父代C株的生物学特性和免疫原性，这说明C株全长cDNA可作为基质以开发活的重组CSFV标记疫苗�

猪瘟病毒全长感染性cDNA标记疫苗，可有效地区别自然感染猪群与疫苗免疫猪群，为建立快速、准确的猪瘟诊断试剂盒奠定了基础，因此，极有希望成为猪瘟非免疫政策的一个有用工� 2 。同时，猪瘟病毒C株全长感染性cDNA标记疫苗的研制和开发，有望为我国C株弱毒苗在西欧等国的应用开辟新的道路�

展望

随着微生物学、免疫学、病毒分子生物学和基因工程研究的不断深入，进一步探索猪瘟病毒感染机理，研制和开发能广泛应用的新型猪瘟疫苗和建立准确、特异、敏感的检测方法都将成为可能，不远的将来，将会有越来越多成本低、使用方便、免疫力强、保护期长的新型猪瘟疫苗诞生。但目前大多数新型猪瘟疫苗的研究仍处于实验室阶段，如何克服新型猪瘟疫苗各自不足之处，并有效地预测和预防基因改造所带来的潜在危害，把实验室研究和产业化生产结合起来，充分发挥各种新型猪瘟疫苗的优势，将是今后努力的方向、�/P>

猪瘟 (Classical swine fever� CSF)是一种高度接触� 传染� ，对养猪业危害极大，其病� 猪瘟 病毒 (Classical swine fever virus，CSFV)为单股正链RNA 病毒 ，属于黄病毒�?Flaviridae)瘟病毒属(Pe...

2019-10-09 10:42:30