新疆哈族奶酪中产蛋白酶非发酵剂乳酸菌筛选及其系统发育分析最新研究进展|微生态前沿
笔者将采集10份新疆塔城地区哈萨克族牧民自制的奶酪为作初筛原料，用改良的ROGOSA和MRS两种培养基对其分离纯化，共筛选出43株菌种，其中球菌32株，杆菌11株。对筛选出的菌株进行产蛋白酶和菌株自溶能力测定，结合16S rDNA序列同源分析和建立系统发育树分析，对挑选出的10株优势菌进行了菌株分子生物学鉴定。鉴定结果表明：菌株R6-6自溶度最高，为42.32％；而自溶度最低的菌株为R4-4，达到6.21％；菌株R2-2、R4-2、R4-7为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）；菌株R3-5、R10-6为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）；菌株R3-2为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；菌株R6-6为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）；菌株R9-5、R9-6为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。其中产蛋白酶的最优势非发酵剂乳酸菌（NSLAB）菌株为乳酸片球菌（P. acidilactici）。1.1 菌株形态特征在对10种奶酪样品进行改良ROGOSA培养基和MRS培养基分离纯化后，筛选得到43株菌株（杆菌11株，球菌32株）。其中一株杆菌及一株球菌的菌落形态及革兰氏染色结果见图1。共同的特点是边缘整齐，质地较软，呈乳白色，富有光泽，闻起来有一股酸味，革兰氏染色均为紫色显阳性。
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1.2 产蛋白酶NSLAB菌株的筛选结果由于菌株产蛋白酶后水解培养基中脱脂乳粉蛋白，使得原本不透明的培养基变透明。以菌落透明圈作为初筛依据，选取的每个样品分离出来的菌进行产蛋白酶NSLAB菌株筛选，部分菌株菌落透明圈的产生情况见图2。其中43株菌落透明的产生情况可以看出，有32株菌产蛋白酶，产蛋白酶达到74.4％。由图2可知，菌株R3-2、R4-7、R7-1产蛋白酶周围都有明显水解圈，菌株R3-3则没有水解圈的产生，说明菌株R3-3不产蛋白酶。
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1.3 产蛋白酶的32株菌进行自溶度测定
NSLAB的自溶受很多因素影响，所谓的自溶即是在一定的条件下，细胞自身的类水解细胞壁肽聚糖的网络结构，造成细胞裂解［18］。NSLAB快速自溶会带来可观的经济效益，因为自溶可以使大量的胞内酶得以释放。选取产蛋白酶的32株菌进行自溶度测定，结果见图3。
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1.4 菌株16S rDNA分析结果
通过对10株菌株的16S rDNA序列的PCR扩增，电泳图结果见图4。对10株NSLAB进行进一步分子学鉴定，通过扩增各菌株的16S rDNA基因序列，并与NCBI数据库中的已知序列进行比对，选择与其相似性最高的典型菌株，进行相似性分析，并使用Mega5.05软件中的邻接法（neighbor- joining，NJ），自展值（bootstrap）设为1 000构建系统发育树，结果见图5。由图5可知，菌株R5-2与Pediococcus lolii 的同源性为99％，菌株R3-5、R10-6与乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的同源性分别为99％、100％，因Pediococcus lolii 在NCBI数据库中属于乳酸片球菌种（Pediococcus acidilactici），即将菌株R5-2、R3-5和R10-6共同鉴定为乳酸片球菌；菌株R3-2与戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）同源性达到100％，即鉴定为戊糖片球菌；菌株R6-6与干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）同源性为100％，即将其鉴定为干酪乳杆菌；菌株R9-5、R9-6与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）同源性分别为100％、99％，故将其鉴定为鼠李糖乳杆菌；菌株R2-2、R4-2、R4-7与表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的同源性均达到100％，即可鉴定为表皮葡萄球菌。
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小结：
笔者将采集新疆塔城地区哈萨克族牧民自制的奶酪为作初筛原料，通过分离纯化、产蛋白酶和菌株自溶能力测定实验、16S rDNA序列同源分析和建立系统发育树分析，对挑选出的10株优势菌进行了菌株分子生物学鉴定。鉴定结果表明：菌株R6-6自溶度最高，为42.32％；而自溶度最低的菌株为R4-4，达到6.21％；菌株R2-2、R4-2、R4-7为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）；菌株R3-5、R10-6为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）；菌株R3-2为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；菌株R6-6为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）；菌株R9-5、R9-6为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。其中产蛋白酶的最优势非发酵剂乳酸菌（NSLAB）菌株为乳酸片球菌（P. acidilactici）。
参考文献
杜紫萱,卢士玲等. 新疆哈族奶酪中产蛋白酶非发酵剂乳酸菌的筛选及其系统发育分析.中国酿造，2016,35(5):20-24。
CASEY M G,HAI J P,GRUSKOVNJAK J,et al. Characterisation ofthe non-starter lactic acid bacteria （NSLAB） of Gruyere PDO cheese［J］.Dairy Sci Tech,2006,86,(3)407-414。
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