金线莲组培快繁技术研�

金线莲组培快繁技术研穵�/p> /> 金线莲种子微小，由未成熟的胚及数层种皮细胞构成，自然萌发率和养殖率低，目剌�strong class="keylink">市场上货源主要来自于野生采挖，产品一直处于供不应求的状况。近年来，随着对其药效学和临床应用研究的深入，对金线莲药用价值的认识进一步提高，其市场货源紧缺的状况更为严峻，野生资源也不断遭到破坏性采挖，以致于处于濒临灭绝之地。本研究旨在采用组织培养技术，解决金线莲种苗来源，加快人工栽培，以保护金线莲野生资源、稳定市圹�strong class="keylink">供应。现将有关实验结果如下� /> 1、材料与方法 /> 1.1 材料。无菌养殖体系的建立为浙江金线莲野生种源，其它实验为继代培养的不定芽及无根幼苗茎段� /> 1.2 无菌养殖体系的建立。取生长健壮、无病虫害的植株，去叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂�?�? min，然后用流水冲洗30 min。在超静工作台前，用75% 酒精湿润5�? s，放�?.1%的HgCl溶液灭菌12�?3 min，用无菌水冲�?�?次。将消毒好的茎按上段（具茎尖）、中段和下段（匍匐茎段）切成长约1.5�? cm，带�?�?个节间的小段，分别接种于MS+6－BA 4.0 mg/L +NAA 0.4 mg/L 培养基上，pH5.6，蔗�?.5%，琼�?.7%。培养条件为：温�?25��2）℃ ，光照时�?2 h/d，光照强�? 500�? 000 lx� /> 1.3 不定芽诱� /> 1.3.1 基本培养基对不定芽诱导的影响　采用单因素实验，培养基选用MS（Murashige-Skoog）［3］，1/2MS（大量元素减半，其他成分不变），VW(Vacin & Went)，B5（Gamborg?Miller & Ojima）和KC(Knudson C)�?种，分别添加6－BA 4.0mg/L，NAA 1.0 mg/L� /> 1.3.2 激素对不定芽诱导的影响　以MS为基本培养基，添加不同种类及浓度的细胞分裂素和生长素� /> 上述实验选取无菌健壮植株，切取长�?�?.5 cm，带有一个节间的茎中段，每处理接10个茎节，重复3次。培养期间定时观察不定芽生长情况，培�?0 d后统计不定芽数。其它条件同实验��1.2��项� /> 1.4 壮苗培养 /> 1.4.1 激素对幼苗生长和发根的影响　�?/2MS为基本培养基，NAA�?�? mg/L 5个处理，6－BA�?.5�?.0�?.5 mg/L 3个处理，�?5个处理� /> 1.4.2 添加物对幼苗生长和发根的影响�?/2MS＋NAA 2.0 mg/L�?－BA 0.5 mg/L为基本培养，考察马铃薯提取物、香蕉提取物、苹果提取物、椰子汁�?种天然有机物和活性炭对金线莲幼苗生长的影响� /> 上述每种培养基均接入经增殖培养高�? cm，具3�?节间、有1�?片的无根幼苗，每处理接种接无根幼�?0株，重复3次。培养后每隔15 d观察生长情况1次，�?个月考察每株净增加的叶片数、重量及发根数，并进行数理统计分析� /> 1.5 移栽 选苗高约6�? cm，茎基直径约2 mm，丛生根�?�?条的试管苗，炼苗4 d后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移人直径�?5 cm，装有不同基质的土盆中，考察不同基质对金线莲试管苗成活率的影响。移栽前，实验基质均�?5%多菌灵可湿性粉�?00倍溶液浇透消毒。实验条件为遮荫�?0%的荫棚，保持空气相对湿度�?0%�?0%。如发现有病死植株，及时拔除。每处理5盆，每盆�?株，重复3次，移栽3个月后考察成活株数，并进行数理统计分析� /> 2、结� /> 2.1 无菌养殖体系的建�?nbsp; 实验表明，外植体茎段的分化程度对诱导结果存在一定的影响。从�?可知，上、中段茎均能萌动生长。上段茎因有顶芽的存在，顶端优势表现较为强烈，因而以生长为主，不定芽发生较少，平均芽增殖数为0.6个；中段茎不定芽发生快、量大、长势好，平均芽增殖数为4.05个，并形成多枝丛生状。下段茎由于组织相对老化，虽有不定芽发生，但发生量与生长势均较弱。这和陈自力�?］报道的结果一致� /> 从实验中观察到，不定芽的产生以侧芽萌生为主。一般在培养15�?0 d后，茎节上潜伏的叶腋芽萌动膨大，芽丛在节的四周萌出，起初为白色略带黄色，随着培养时间加长，芽不断伸展，逐渐转为黄绿色，形成主芽。叶腋芽是单生的，极个别节上能对生两个腋芽，未发现茎部或切口处长出不定芽。培�?0 d左右，主芽基部的节再生侧�?称一级侧�?�?5 d左右一级侧芽节上又可发生二级侧芽，随着芽的生长、出现叶片，节处毛并产生根，外被浓密的白色绒毛，从而形成完整小植株。培�?个月后每天观察，侧芽分生组织的增殖，一般只出现主芽和一二级侧芽或苗；培�?个月以上，主芽、侧芽较高，叶片较多、大，只有少数出现三级侧芽或苗。这种腋芽萌生的增殖形成了主轴分枝型的芽苗，随培养时间或继代养殖代数的增加，或激素的作用，芽或苗因节间短，多数为形成似不定芽或丛生苗。培养过程中，未见愈伤组织，也没有发现有原球茎和类原球茎产生� /> �? 金线莲茎段外植体不定芽诱导（略） /> 2.2 不定芽诱� /> 2.2.1 基本培养基对不定芽诱导的影响　以金线莲的茎节段作为外植体，腋芽能快速萌发出不定芽体。经60 d的培养，增殖倍数可达3.1�?.4倍。但基本培养基对不定芽的诱导具有明显的影响，MS，B5培养基不定芽增殖率分别为5.4倍与5.2倍，比其它培养基增加23.8%�?4.2%� /> �? 基本培养基对金线莲不定芽诱导的影响（略） /> 经LSR差异显著性测定，MS，B5培养基之间无明显差异，与1/2MS，KC和VW之间存在极显著差异，且MS，B5培养基上诱导产生的不定芽色绿、粗壮（见表2），表明MS，B5培养基适合作为金线莲茎段不定芽诱导的基本培养基�?］� /> 2.2.2 激素对不定芽诱导的影响 激素种类、水平与配比对组织培养快速养殖在效率存在明显的影响，6-BA、KT和NAA�?种常用生长调节剂，其添加量对金线莲不定芽增殖的影响很大。结果见�?。从�?可知，同为细胞分裂素�?-BA，KT在相同的添加量下对不定芽的增殖效果差异极显著�?-BA比KT的增殖率提高46.0%�?5.0%，表�?-BA比KT更适合金线莲茎节不定芽的诱导� /> 6-BA的浓度也影响不定芽诱导效果。在添加量小�?.0 mg/L的情况下，随浓度的提高，不定芽增殖率明显上升，添加量�?.0 mg/L的不定芽增殖率比2.0�?.0 mg/L分别提高22.1%�?7.6%。当6-BA添加量达�?.0 mg/L时，其增殖率还出现下降趋势，表明本实验条件下6-BA添加的适宜量为4.0 mg/L� /> �? 激素对金线莲不定芽诱导的影响（略） /> 生长素NAA对金线莲不定芽的诱导与生长具有明显的促进作用。从�?可以看出，添加了NAA的培养基不定芽增殖量与生长明显较不添加的好，芽体粗壮、色浓绿，其中添�?.5 mg/L的表现最好，添加1.0 mg/L的其次，但二者间差异未达到显著水平；与其它不添加NAA的相比差异达极显著水平。表明在本试验条件下NAA适宜添加的量�?.5�?.0 mg/L� /> 2.3 壮苗培养 /> 2.3.1 激素对幼苗生长的影�?nbsp; 在金线莲壮苗培养中，NAA�?-BA对促进幼苗生长的影响更为明显。结果见�?。NAA浓度低于3 mg/L时，对幼苗生长有促进作用，随浓度的增加，叶片净增量、发根数和鲜重净增量明显增加，当浓度达到4.0 mg/L时，叶片净增量、发根数和鲜重净增量增加不明显�?-BA�?.5 mg/L情况下，比不加的具有一定的促进作用，但未达显著水平；在浓度�?.0 mg/L�?.5 mg/L情况下，叶片净增量、发根数和鲜重净增量反而减少，但在幼苗基部观察到丛生状不定芽的产生，表�?-BA在浓度高�?.0 mg/L情况下，有利于金线莲不定芽的生成，对幼苗生长不利� /> 从表4也可以看出，处理9�?0号在发根数、鲜生净增量方面较其它处理明显提高，达极显著差异；在叶片净增量方面，除与处�?3�?4号无明显差异外，与其它处理之间的差异达极显著水平，表明在金线莲壮苗培养中，NAA适宜添加的量�?.0�?.0 mg/L�?-BA 添加量为0.5 mg/L或不加� /> �? 激素对金线莲幼苗生长的影响（略� /> 2.3.2 活性炭与有机添加物对幼生长的影�?nbsp; 结果见表5。从�?可知，不同的添加物对金线莲幼苗生长的影响表现不一，香蕉、椰子汁对促进幼苗生长最为有利，叶片净增量、发根数和鲜重净增量均高于其它处理，二者间无明显差异；马铃薯对幼苗生长不利，与其它处理相比均存在极显著差异水平。活性炭对金线莲幼苗生长具有一定的促进作用，在添加0.3%情况下，叶片净增量、发根数和鲜重净增量与对照相比均显著提高，差异达极显著水平；但与香蕉、椰子汁处理相比，其促进幼苗生长的作用不如前二者，除发根数无差异外，叶净增量与香蕉、椰子汁处理差异达显著水平，鲜重净增量差异达极显著水平。同时观察到活性炭、香蕉和椰子汁新发根洁白、粗壮。试验结果表明添�?0%香蕉和椰子汁最适宜金线莲幼苗的生长�?nbsp; /> 2.4 移栽 金线莲试管苗移栽3个月后的植株成活情况见表6。从�?中可以看出，处理7和处�?保持100%的成活率，处�?和处�?的植株成活率也在93%以上，处�?的成活率最低，仅为56%。经LSR差异显著性测定，处理3�?�?�?号之间无明显差异，与处理5�?号差异达显著水平、与处理1�?�?号差异达极显著水平。表明在菜园土中加入粗砂、木屑能明显提高金线莲试管苗移栽的成活率，适宜添加的比例为1份菜园土中加入粗�?份、木�?份或粗砂1份、木�?份，要求充分混匀� /> �? 种植基质对金线莲试管苗移栽成活率的影响（略） /> 3、小� /> 金线莲不同部位的茎间对不定芽的诱导结果存在明显的差异，以不含顶芽和长根的中间段茎节为好，不定芽增殖率�?倍以上� /> 采用金线莲中间茎节作外植体诱导不定芽萌发时，适宜的培养基为MS或B5�?-BA 4.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L�?.0 mg/L，蔗糖浓度为2.5%� /> 适宜的壮苗培养基�?/2MS＋NAA 3.0 mg/L�?-BA 0.5 mg/L＋香蕉提取物20%（或椰子�?0%），蔗糖浓度�?.0%�?.4试管苗在充分混匀�?份菜园土�?份粗砂（2�? mm）＋1份木屑，�?份菜园土＋粗�?份＋木屑2份的基质中生长良好，3个月后成活率�?00%� />